基于脂肪酸探究青蝦擾動(dòng)作用對(duì)沉積物中有機(jī)質(zhì)降解的影響

封功成，侯詒然，李 冰，季 鵬，駱加偉，陶 冶，張明豪，朱 健，

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081)

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中，自然和人為輸入養(yǎng)殖池塘中的氮、磷，至少有50%富集到池塘沉積物中[1]。大量沉降在塘底的殘餌、糞便、尸體等在腐敗分解過程中產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，直接影響著水產(chǎn)養(yǎng)殖物的存活和生長[2]。底棲動(dòng)物作為沉積物-水界面的有機(jī)組成部分，其生命活動(dòng)對(duì)改變沉積物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，加速沉積物-水界面間的物質(zhì)交換，具有非常重要的生態(tài)學(xué)意義[3]。研究表明，底棲生物攝食、避敵、排泄等行為，會(huì)對(duì)水體沉積物具有一定的擾動(dòng)作用，影響有機(jī)質(zhì)、營養(yǎng)鹽等各種污染物的遷移轉(zhuǎn)化[4]。Webb等[5]通過對(duì)長腕和尚蟹(Mictyrislongicarpus)的研究發(fā)現(xiàn)底棲動(dòng)物的鉆孔、筑洞等行為能夠加速有機(jī)物質(zhì)的降解；Plante等[6]研究發(fā)現(xiàn)底棲動(dòng)物能夠改變微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)微生物對(duì)有機(jī)顆粒的降解。

青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，是一種典型的底棲生物。具有食性雜、生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，是我國淡水蝦類的一個(gè)重要養(yǎng)殖品種[7,8]。研究表明，通過蝦類擾動(dòng)作用，經(jīng)再懸浮、礦化分解、釋放等過程，養(yǎng)殖池塘底部沉積物中的碳、氮、磷等物質(zhì)會(huì)回到水體中，減少沉積物的有機(jī)負(fù)荷[9]。因此，青蝦不僅是一種重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種，而且也是一種潛在的生物修復(fù)種。

脂類化合物相對(duì)于蛋白質(zhì)和糖類有較高的穩(wěn)定性，其作為生物標(biāo)記物在全球碳循環(huán)和古海洋學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用[10,11]，但在淡水養(yǎng)殖領(lǐng)域中，通過脂肪酸變化指征沉積物中有機(jī)質(zhì)降解的研究鮮有報(bào)道。本研究選用青蝦作為試驗(yàn)對(duì)象，室內(nèi)模擬池塘養(yǎng)殖環(huán)境，通過對(duì)沉積物理化性質(zhì)、脂肪酸組成的分析，探究青蝦擾動(dòng)作用對(duì)沉積物中有機(jī)質(zhì)降解的影響，為淡水池塘養(yǎng)殖的綠色可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所需青蝦和底泥均來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興大浦科研實(shí)驗(yàn)基地。選取健康無病、規(guī)格一致(3.00±0.10)g的青蝦作為養(yǎng)殖對(duì)象，在(26.5±0.5)℃水溫下，于玻璃缸中暫養(yǎng)14 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)置試驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組3個(gè)平行，試驗(yàn)在6個(gè)長方體有機(jī)玻璃缸(63 cm×43 cm×43 cm)進(jìn)行，玻璃缸中均鋪設(shè)5.5 cm底泥，為保證底泥的一致性和均一性，所需底泥在使用前需自然曬干，粉碎研磨過100目篩后完全混勻。鋪設(shè)完成后，統(tǒng)一加水至30 cm，自然沉降14 d，每個(gè)玻璃缸中設(shè)置3個(gè)規(guī)格一致的PVC管(直徑5.0 cm，長5.0 cm)作為青蝦人工巢穴。挑選18只活力充沛青蝦，隨機(jī)放入3個(gè)玻璃缸中，每缸6只，飼養(yǎng)90 d。

選用江蘇冠乾特種水產(chǎn)飼料有限公司的配合飼料(粗蛋白36%，粗脂肪6%)作為暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)期間投喂料，具體脂肪酸組成及含量見表1。本實(shí)驗(yàn)為嚴(yán)格的單因素對(duì)照實(shí)驗(yàn)，除青蝦外其余實(shí)驗(yàn)條件均嚴(yán)格控制一樣。實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)組和空白組每天16 ∶00投料一次，將飼料按青蝦總重量的3%稱取兩份，并和少量水混合均勻，每個(gè)玻璃缸均勻潑灑投喂；實(shí)驗(yàn)期間不進(jìn)行補(bǔ)水、換水操作，水溫保持在(26.5±0.5)℃，并保持連續(xù)充氧狀態(tài)。

1.2 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)周期90 d，實(shí)驗(yàn)第90天進(jìn)行樣品采集。用2 cm直徑的塑料針管式采泥器對(duì)玻璃缸內(nèi)沉積物進(jìn)行采集，每個(gè)玻璃缸中隨機(jī)選取6個(gè)點(diǎn)，采集表層0～1 cm沉積物，將同一玻璃缸中采集的6份樣品混合均勻，冷凍干燥研磨過100目篩后，放入樣品袋中，放置于-80℃冰箱保存待測。

1.3 指標(biāo)測定

沉積物中脂肪酸提取與測定參照葉新榮[12]的氣相色譜法，并稍作修改。稱取約5.0 g沉積物干樣于50 mL玻璃試管中，首先加入1.0 mL配制的內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入15 mL氯仿-甲醇溶液(氯仿/甲醇=2 ∶1，體積比)振蕩提取，過濾，再用10 mL氯仿-甲醇溶液重復(fù)振蕩提取過濾2次，合并濾液并揮干。加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，60 ℃水浴30 min，冷卻至室溫。加入2 mL 25%三氟化硼-甲醇溶液，60 ℃水浴20 min，冷卻至室溫。加入2 mL正己烷和2 mL飽和氯化鈉，振蕩萃取，靜止分層。小心吸取上層正己烷和脂肪酸甲酯混合物，用微量進(jìn)樣器吸取1μL注入氣相色譜儀(島津Nexis GC-2030，日本)，采用火焰電離檢測器。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸出峰時(shí)間確定脂肪酸種類，通過內(nèi)標(biāo)法測定脂肪酸含量。

沉積物中有機(jī)碳(TOC)及總氮(TN)含量測定參照白亞之[13]的沉積物TOC和TN分析方法。將沉積物樣品加入5%的稀鹽酸多次攪拌后在低溫水浴環(huán)境中靜置3 h以上，以便完全去除碳酸鹽。然后將樣品置于離心管內(nèi)，用蒸餾水離心清洗，使其呈中性，低溫干燥去除碳酸鹽的樣品，研磨至粉末狀。取10 mg的樣品，通過元素分析儀(EA3000，意大利)測定TOC及TN含量，其中TOC、TN分析誤差小于0.5%。

沉積物含水率(moisture content，MC)采用105 ℃烘干恒重法測定(GB/T50123-1999)；沉積物pH和氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)選用METTLER TOLEDO InLab?進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

1.4.1 含水率

沉積物含水率(MC)按下式計(jì)算：

式中：W1—烘干前樣品重量(g)；

W2—烘干后樣品重量(g)。

1.4.2 脂肪酸降解參數(shù)

脂肪酸降解參數(shù)主要包括：脂肪酸的平均碳鏈長度(average carbon length，ACL)；短鏈脂肪酸之和(∑

(1)ACL=∑(zn×n)/∑zn

式中：Zn—具有n個(gè)碳的脂肪酸含量

(2)L/H=(C12+C14+C15+C16+C17+C18+C20)/(C22+C24)

(3)C20 ∶1-5/C20 ∶0=(C20 ∶1+C20 ∶2+C20 ∶3+C20 ∶4+C20 ∶5)/C20 ∶0

1.4.3 碳氮比

沉積物碳氮比(C/N)[16]公式如下：

C/N=TOC/TN

1.4.4 有機(jī)指數(shù)

為評(píng)價(jià)水環(huán)境沉積物有機(jī)污染狀況，引入有機(jī)指數(shù)(organic index，OI)[16]，其公式為：

OI=WTOC×WTON

WTON=TN×0.95

式中：OI為有機(jī)指數(shù)；WTOC為有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)；WTON為有機(jī)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)；TN為總氮含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本文使用Excel、GraphPad Prism6進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)計(jì)算、相關(guān)性分析及作圖，并使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)及相關(guān)性分析，用Duncan’s多重比較分析組別的差異顯著性，P<0.05則為有顯著差異，P<0.01則為有極顯著差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析前，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 沉積物理化性質(zhì)

表2為第90天實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物pH、ORP及MC分析結(jié)果，從表中可以看出，實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物pH、ORP及MC均存在顯著差異，其中pH與ORP呈極顯著差異，MC呈顯著差異。實(shí)驗(yàn)組pH較空白組顯著降低0.93，ORP較空白組顯著增加54.34，MC較空白組顯著增加6.59%。

表2 沉積物理化參數(shù)Tab.2 Physical and chemical parameters of sediments

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 沉積物脂肪酸組成及降解參數(shù)

2.2.1 沉積物脂肪酸組成及其含量

將沉積物中游離態(tài)脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)。由表3可見，本實(shí)驗(yàn)鑒定出沉積物中18種脂肪酸，所有樣品均顯示以低碳數(shù)脂肪酸占絕對(duì)優(yōu)勢，SFA為9種，MUFA為4種，PUFA為5種。其中，實(shí)驗(yàn)組SFA、MUFA及PUFA分別占實(shí)驗(yàn)組FA的58.57%、35.45%及5.98%，空白組SFA、MUFA及PUFA占空白組FA的57.06%、32.16%及10.78%；實(shí)驗(yàn)組FA、SFA及PUFA含量較空白組顯著降低81.60 μg/g、45.39 μg/g及12.53 μg/g。

表3 沉積物脂肪酸組成及含量(干重)Tab.3 Composition and content of fatty acids in sediments(dry weight) μg/g

2.2.2 脂肪酸降解常數(shù)

沉積物脂肪酸降解參數(shù)主要為ACL,L/H，C20 ∶1-5/C20 ∶0。其中實(shí)驗(yàn)組ACL為17.46±0.01，空白組為17.30±0.05，存在極顯著差異；實(shí)驗(yàn)組與空白組L/H分別為：8.91±2.09、9.43±0.66；實(shí)驗(yàn)組C20 ∶1-5/C20 ∶0為0.97±0.11，空白組為0.97±0.11，無顯著差異。

結(jié)合沉積物理化參數(shù)，分析脂肪酸降解參數(shù)ACL與MC、ORP之間的關(guān)系，ACL與MC呈顯著正相關(guān)(MC=39.76ACL-614.6，R2=0.8126，n=6，P<0.05)，與ORP呈顯著正相關(guān)(ORP=290.3ACL-5179，R2=0.7756，n=6，P<0.05)。

2.3 沉積物碳氮含量及有機(jī)指數(shù)

表4 沉積物碳氮含量及有機(jī)指標(biāo)Tab.4 Carbon and nitrogen content and organic index in sediments

注：有機(jī)污染評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[16]：OI≥0.50為有機(jī)污染；0.20≤OI<0.50為尚清潔。

實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物碳氮含量及有機(jī)指數(shù)如表4所示，其中TOC和TN含量差異不顯著；實(shí)驗(yàn)組和空白組C/N存在顯著差異，實(shí)驗(yàn)組C/N較空白組顯著降低0.25。實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物OI計(jì)算結(jié)果如表4所示，實(shí)驗(yàn)組沉積物OI均值為0.48，空白組沉積物OI均值為0.53，實(shí)驗(yàn)組沉積物處于尚清潔狀態(tài)，空白組沉積物處于有機(jī)污染狀態(tài),這表明青蝦擾動(dòng)作用對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物有機(jī)污染狀況起到一定的改善作用。

3 討論

3.1 脂肪酸組成

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物中C16 ∶0含量占脂肪酸總含量比例最大，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因有以下兩點(diǎn)：一是由于C16 ∶0來源主要包括藻類和微生物[17]，沉積物中微生物除了通過去飽和等一系列過程將C16 ∶0轉(zhuǎn)化成各種不飽和脂肪外，還能夠通過碳鏈的延長合成不同形式的脂肪酸，這種延長往往在合成到C16 ∶0后終止，由于C16 ∶0在新陳代謝過程中的獨(dú)特地位，使其在沉積物中具有積聚并且較長時(shí)間以較高濃度存在的可能[18]，二是C16 ∶0是長鏈脂肪酸氧化降解的產(chǎn)物[19]。在這兩個(gè)過程共同作用下，沉積物中C16 ∶0含量最高現(xiàn)象是合理的。

研究結(jié)果顯示，青蝦擾動(dòng)作用顯著降低沉積物中FA、SFA、PUFA含量，與Ding等[20]研究結(jié)果類似；孫立群等[18]通過模擬試驗(yàn)研究刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)對(duì)微藻脂肪酸在沉積物中降解影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，刀額新對(duì)蝦擾動(dòng)作用能顯著加快藻類中脂肪酸降解。實(shí)驗(yàn)組C16 ∶1含量較空白組存在顯著差異，但MUFA較空白組無顯著差異，與不飽和脂肪酸較飽和脂肪酸更易降解的研究結(jié)論不一致[19]，其原因可能是沉積物及飼料中MUFA含量相對(duì)較低、室內(nèi)模擬試驗(yàn)的局限性等造成的。

3.2 脂肪酸降解參數(shù)

眾多研究表明，沉積物游離態(tài)脂肪酸降解參數(shù)ACL、C20 ∶1-5/C20 ∶0和L/H一定程度上可以反應(yīng)沉積物有機(jī)質(zhì)的降解變化[14,15]。短鏈脂肪酸相對(duì)于長鏈脂肪酸更易降解[21]，易于降解的短鏈脂肪酸的減少以及長鏈脂肪酸的選擇性富集，導(dǎo)致脂肪酸降解參數(shù)ACL值會(huì)隨沉積物有機(jī)質(zhì)降解程度的增加而升高[22]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組ACL明顯大于空白組，這表明青蝦擾動(dòng)作用促進(jìn)沉積物有機(jī)質(zhì)的降解，與李芳芳[21]研究結(jié)果類似。不飽和脂肪酸的化學(xué)鍵易斷裂，使得沉積物中不飽和脂肪酸含量減少，從而導(dǎo)致C20 ∶1-5/C20 ∶0值的減少[23]。本實(shí)驗(yàn)中L/H以及C20 ∶1-5/C20 ∶0值無顯著差異，未產(chǎn)生差異可能與實(shí)驗(yàn)周期長短、指標(biāo)適用性和敏感程度不同及室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)的局限性等因素有關(guān)。

3.3 沉積物理化參數(shù)

青蝦擾動(dòng)作用能顯著增加沉積物含水率，分析原因是青蝦的攝食、爬行等擾動(dòng)作用使沉積物表層變得疏松，促進(jìn)了沉積物-水界面的物質(zhì)交換，使得沉積物有較高的含水量，這與張雷等[24]研究一致。其他研究表明，生物擾動(dòng)作用能顯著增加沉積物的含水率及總微生物活性，從而促進(jìn)沉積物中有機(jī)質(zhì)的降解[25,26]。實(shí)驗(yàn)組ORP顯著大于空白組，其原因可能是生物體通過攝食和爬行等活動(dòng)產(chǎn)生的擾動(dòng)作用可以增加沉積物中的氧含量，提供更多的電子受體，提高沉積物的ORP[27]；吳金浩等[28]研究表明，沉積物ORP與有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，即沉積物較強(qiáng)的氧化狀態(tài)是其有機(jī)質(zhì)降解的有利條件。本實(shí)驗(yàn)中青蝦擾動(dòng)作用促使沉積物pH顯著降低，這與李耀睿等[29]研究結(jié)果一致，分析原因可能有以下幾點(diǎn)：較多氧氣進(jìn)入沉積物后，加速沉積物中有機(jī)物的有氧分解，產(chǎn)生較多CO2；沉積物氧化作用提高，硝化作用增強(qiáng)需消耗堿性物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致pH下降；低價(jià)金屬(Fe2+和Mn2+)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致沉積物酸化；沉積物釋放的鐵錳離子與OH-的結(jié)合作用大于H+和OH-的結(jié)合作用，因此其水解作用使得沉積物中H+增加，導(dǎo)致pH值較低[30,31,32]。通過相關(guān)性分析，結(jié)合ACL指征作用，青蝦擾動(dòng)作用顯著提高沉積物MC和ORP，為促進(jìn)有機(jī)質(zhì)降解創(chuàng)造有利條件。

3.4 沉積物碳氮含量

TOC是描述沉積物有機(jī)質(zhì)含量的重要指標(biāo)，C/N除了能有效指示沉積物有機(jī)質(zhì)來源外，還能描述沉積物有機(jī)質(zhì)分解速度。Nickell等[33]研究表明，C/N低意味著沉積物中含有較高的不穩(wěn)定有機(jī)物，其含量的增加有利于有機(jī)質(zhì)的礦化反應(yīng)，C/N的變化與有機(jī)質(zhì)分解速度之間呈反比關(guān)系[34]。本研究結(jié)果顯示，青蝦擾動(dòng)作用顯著降低沉積物C/N，增強(qiáng)沉積物中有機(jī)質(zhì)的降解程度，與李芳芳[21]研究結(jié)果類似。實(shí)驗(yàn)組與空白組沉積物TN和TOC均無顯著差異，可能與實(shí)驗(yàn)周期較短有關(guān)。青蝦除通過擾動(dòng)作用改變沉積物微環(huán)境來促進(jìn)沉積物中有機(jī)質(zhì)降解外，其攝食行為也能造成沉積物中有機(jī)質(zhì)含量的減少，以及在沉積物表層爬行等活動(dòng)可能造成沉積物的再懸浮，一些不能被攝食的食物雜質(zhì)會(huì)被直接噴射到上層水體中，造成上層水體的渾濁，部分飼料殘餌及少量沉積物也由此轉(zhuǎn)移到上層水體中，Webb等[5]研究生物擾動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)底棲甲殼動(dòng)物能夠擴(kuò)大溶質(zhì)運(yùn)輸、加速有機(jī)物降解。影響沉積物有機(jī)質(zhì)降解的因素除擾動(dòng)、氧化還原環(huán)境、酸堿度及含水率外，沉積物中礦物含量、顆粒粒徑大小、微生物含量及活性等因素也可能對(duì)有機(jī)質(zhì)的保存與降解起著重要的控制作用，有待于進(jìn)一步研究以便更好解釋沉積物中有機(jī)質(zhì)的保存與降解機(jī)理[35]。

綜上所述，青蝦擾動(dòng)作用改變了沉積物的MC、ORP等理化指標(biāo)，為沉積物中有機(jī)質(zhì)的降解創(chuàng)造了有利條件。同時(shí)，ACL值的差異性也說明青蝦擾動(dòng)作用可以促進(jìn)沉積物中有機(jī)質(zhì)的降解，從而在一定程度上避免因沉積物中有機(jī)質(zhì)過度積累所導(dǎo)致的養(yǎng)殖環(huán)境有機(jī)污染的風(fēng)險(xiǎn)。但不可忽視的是，實(shí)驗(yàn)組和空白組脂肪酸降解參數(shù)中，L/H與C20 ∶1-5/C20 ∶0指標(biāo)無顯著差異，可能與實(shí)驗(yàn)周期長短、指標(biāo)適用性和敏感程度不同等因素有關(guān)，實(shí)驗(yàn)室模擬試驗(yàn)為下一階段野外實(shí)驗(yàn)時(shí)，更好的開展針對(duì)性實(shí)驗(yàn)和分析提供寶貴經(jīng)驗(yàn)。