基于脂肪酸探究青蝦擾動作用對沉積物中有機質(zhì)降解的影響

封功成，侯詒然，李 冰，季 鵬，駱加偉，陶 冶，張明豪，朱 健，

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫214081)

近年來，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中，自然和人為輸入養(yǎng)殖池塘中的氮、磷，至少有50%富集到池塘沉積物中[1]。大量沉降在塘底的殘餌、糞便、尸體等在腐敗分解過程中產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，直接影響著水產(chǎn)養(yǎng)殖物的存活和生長[2]。底棲動物作為沉積物-水界面的有機組成部分，其生命活動對改變沉積物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，加速沉積物-水界面間的物質(zhì)交換，具有非常重要的生態(tài)學(xué)意義[3]。研究表明，底棲生物攝食、避敵、排泄等行為，會對水體沉積物具有一定的擾動作用，影響有機質(zhì)、營養(yǎng)鹽等各種污染物的遷移轉(zhuǎn)化[4]。Webb等[5]通過對長腕和尚蟹(Mictyrislongicarpus)的研究發(fā)現(xiàn)底棲動物的鉆孔、筑洞等行為能夠加速有機物質(zhì)的降解；Plante等[6]研究發(fā)現(xiàn)底棲動物能夠改變微生物群落結(jié)構(gòu)，促進微生物對有機顆粒的降解。

青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，是一種典型的底棲生物。具有食性雜、生長快、適應(yīng)性強、營養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖經(jīng)濟效益高等特點，是我國淡水蝦類的一個重要養(yǎng)殖品種[7,8]。研究表明，通過蝦類擾動作用，經(jīng)再懸浮、礦化分解、釋放等過程，養(yǎng)殖池塘底部沉積物中的碳、氮、磷等物質(zhì)會回到水體中，減少沉積物的有機負荷[9]。因此，青蝦不僅是一種重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟品種，而且也是一種潛在的生物修復(fù)種。

脂類化合物相對于蛋白質(zhì)和糖類有較高的穩(wěn)定性，其作為生物標記物在全球碳循環(huán)和古海洋學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用[10,11]，但在淡水養(yǎng)殖領(lǐng)域中，通過脂肪酸變化指征沉積物中有機質(zhì)降解的研究鮮有報道。本研究選用青蝦作為試驗對象，室內(nèi)模擬池塘養(yǎng)殖環(huán)境，通過對沉積物理化性質(zhì)、脂肪酸組成的分析，探究青蝦擾動作用對沉積物中有機質(zhì)降解的影響，為淡水池塘養(yǎng)殖的綠色可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

實驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進行，實驗所需青蝦和底泥均來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興大浦科研實驗基地。選取健康無病、規(guī)格一致(3.00±0.10)g的青蝦作為養(yǎng)殖對象，在(26.5±0.5)℃水溫下，于玻璃缸中暫養(yǎng)14 d。實驗設(shè)置試驗組和空白對照組，每組3個平行，試驗在6個長方體有機玻璃缸(63 cm×43 cm×43 cm)進行，玻璃缸中均鋪設(shè)5.5 cm底泥，為保證底泥的一致性和均一性，所需底泥在使用前需自然曬干，粉碎研磨過100目篩后完全混勻。鋪設(shè)完成后，統(tǒng)一加水至30 cm，自然沉降14 d，每個玻璃缸中設(shè)置3個規(guī)格一致的PVC管(直徑5.0 cm，長5.0 cm)作為青蝦人工巢穴。挑選18只活力充沛青蝦，隨機放入3個玻璃缸中，每缸6只，飼養(yǎng)90 d。

選用江蘇冠乾特種水產(chǎn)飼料有限公司的配合飼料(粗蛋白36%，粗脂肪6%)作為暫養(yǎng)以及實驗期間投喂料，具體脂肪酸組成及含量見表1。本實驗為嚴格的單因素對照實驗，除青蝦外其余實驗條件均嚴格控制一樣。實驗期間實驗組和空白組每天16 ∶00投料一次，將飼料按青蝦總重量的3%稱取兩份，并和少量水混合均勻，每個玻璃缸均勻潑灑投喂；實驗期間不進行補水、換水操作，水溫保持在(26.5±0.5)℃，并保持連續(xù)充氧狀態(tài)。

1.2 樣品采集與處理

實驗周期90 d，實驗第90天進行樣品采集。用2 cm直徑的塑料針管式采泥器對玻璃缸內(nèi)沉積物進行采集，每個玻璃缸中隨機選取6個點，采集表層0～1 cm沉積物，將同一玻璃缸中采集的6份樣品混合均勻，冷凍干燥研磨過100目篩后，放入樣品袋中，放置于-80℃冰箱保存待測。

1.3 指標測定

沉積物中脂肪酸提取與測定參照葉新榮[12]的氣相色譜法，并稍作修改。稱取約5.0 g沉積物干樣于50 mL玻璃試管中，首先加入1.0 mL配制的內(nèi)標溶液，然后加入15 mL氯仿-甲醇溶液(氯仿/甲醇=2 ∶1，體積比)振蕩提取，過濾，再用10 mL氯仿-甲醇溶液重復(fù)振蕩提取過濾2次，合并濾液并揮干。加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，60 ℃水浴30 min，冷卻至室溫。加入2 mL 25%三氟化硼-甲醇溶液，60 ℃水浴20 min，冷卻至室溫。加入2 mL正己烷和2 mL飽和氯化鈉，振蕩萃取，靜止分層。小心吸取上層正己烷和脂肪酸甲酯混合物，用微量進樣器吸取1μL注入氣相色譜儀(島津Nexis GC-2030，日本)，采用火焰電離檢測器。最后，根據(jù)標準脂肪酸出峰時間確定脂肪酸種類，通過內(nèi)標法測定脂肪酸含量。

沉積物中有機碳(TOC)及總氮(TN)含量測定參照白亞之[13]的沉積物TOC和TN分析方法。將沉積物樣品加入5%的稀鹽酸多次攪拌后在低溫水浴環(huán)境中靜置3 h以上，以便完全去除碳酸鹽。然后將樣品置于離心管內(nèi)，用蒸餾水離心清洗，使其呈中性，低溫干燥去除碳酸鹽的樣品，研磨至粉末狀。取10 mg的樣品，通過元素分析儀(EA3000，意大利)測定TOC及TN含量，其中TOC、TN分析誤差小于0.5%。

沉積物含水率(moisture content，MC)采用105 ℃烘干恒重法測定(GB/T50123-1999)；沉積物pH和氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)選用METTLER TOLEDO InLab?進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)計算

1.4.1 含水率

沉積物含水率(MC)按下式計算：

式中：W1—烘干前樣品重量(g)；

W2—烘干后樣品重量(g)。

1.4.2 脂肪酸降解參數(shù)

脂肪酸降解參數(shù)主要包括：脂肪酸的平均碳鏈長度(average carbon length，ACL)；短鏈脂肪酸之和(∑

(1)ACL=∑(zn×n)/∑zn

式中：Zn—具有n個碳的脂肪酸含量

(2)L/H=(C12+C14+C15+C16+C17+C18+C20)/(C22+C24)

(3)C20 ∶1-5/C20 ∶0=(C20 ∶1+C20 ∶2+C20 ∶3+C20 ∶4+C20 ∶5)/C20 ∶0

1.4.3 碳氮比

沉積物碳氮比(C/N)[16]公式如下：

C/N=TOC/TN

1.4.4 有機指數(shù)

為評價水環(huán)境沉積物有機污染狀況，引入有機指數(shù)(organic index，OI)[16]，其公式為：

OI=WTOC×WTON

WTON=TN×0.95

式中：OI為有機指數(shù)；WTOC為有機碳質(zhì)量分數(shù)；WTON為有機氮質(zhì)量分數(shù)；TN為總氮含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本文使用Excel、GraphPad Prism6進行常規(guī)數(shù)據(jù)計算、相關(guān)性分析及作圖，并使用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One way ANOVA)及相關(guān)性分析，用Duncan’s多重比較分析組別的差異顯著性，P<0.05則為有顯著差異，P<0.01則為有極顯著差異，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析前，實驗數(shù)據(jù)要進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 沉積物理化性質(zhì)

表2為第90天實驗組與空白組沉積物pH、ORP及MC分析結(jié)果，從表中可以看出，實驗組與空白組沉積物pH、ORP及MC均存在顯著差異，其中pH與ORP呈極顯著差異，MC呈顯著差異。實驗組pH較空白組顯著降低0.93，ORP較空白組顯著增加54.34，MC較空白組顯著增加6.59%。

表2 沉積物理化參數(shù)Tab.2 Physical and chemical parameters of sediments

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 沉積物脂肪酸組成及降解參數(shù)

2.2.1 沉積物脂肪酸組成及其含量

將沉積物中游離態(tài)脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)。由表3可見，本實驗鑒定出沉積物中18種脂肪酸，所有樣品均顯示以低碳數(shù)脂肪酸占絕對優(yōu)勢，SFA為9種，MUFA為4種，PUFA為5種。其中，實驗組SFA、MUFA及PUFA分別占實驗組FA的58.57%、35.45%及5.98%，空白組SFA、MUFA及PUFA占空白組FA的57.06%、32.16%及10.78%；實驗組FA、SFA及PUFA含量較空白組顯著降低81.60 μg/g、45.39 μg/g及12.53 μg/g。

表3 沉積物脂肪酸組成及含量(干重)Tab.3 Composition and content of fatty acids in sediments(dry weight) μg/g

2.2.2 脂肪酸降解常數(shù)

沉積物脂肪酸降解參數(shù)主要為ACL,L/H，C20 ∶1-5/C20 ∶0。其中實驗組ACL為17.46±0.01，空白組為17.30±0.05，存在極顯著差異；實驗組與空白組L/H分別為：8.91±2.09、9.43±0.66；實驗組C20 ∶1-5/C20 ∶0為0.97±0.11，空白組為0.97±0.11，無顯著差異。

結(jié)合沉積物理化參數(shù)，分析脂肪酸降解參數(shù)ACL與MC、ORP之間的關(guān)系，ACL與MC呈顯著正相關(guān)(MC=39.76ACL-614.6，R2=0.8126，n=6，P<0.05)，與ORP呈顯著正相關(guān)(ORP=290.3ACL-5179，R2=0.7756，n=6，P<0.05)。

2.3 沉積物碳氮含量及有機指數(shù)

表4 沉積物碳氮含量及有機指標Tab.4 Carbon and nitrogen content and organic index in sediments

注：有機污染評價標準參考文獻[16]：OI≥0.50為有機污染；0.20≤OI<0.50為尚清潔。

實驗組與空白組沉積物碳氮含量及有機指數(shù)如表4所示，其中TOC和TN含量差異不顯著；實驗組和空白組C/N存在顯著差異，實驗組C/N較空白組顯著降低0.25。實驗組與空白組沉積物OI計算結(jié)果如表4所示，實驗組沉積物OI均值為0.48，空白組沉積物OI均值為0.53，實驗組沉積物處于尚清潔狀態(tài)，空白組沉積物處于有機污染狀態(tài),這表明青蝦擾動作用對養(yǎng)殖環(huán)境沉積物有機污染狀況起到一定的改善作用。

3 討論

3.1 脂肪酸組成

實驗結(jié)果表明，實驗組與空白組沉積物中C16 ∶0含量占脂肪酸總含量比例最大，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因有以下兩點：一是由于C16 ∶0來源主要包括藻類和微生物[17]，沉積物中微生物除了通過去飽和等一系列過程將C16 ∶0轉(zhuǎn)化成各種不飽和脂肪外，還能夠通過碳鏈的延長合成不同形式的脂肪酸，這種延長往往在合成到C16 ∶0后終止，由于C16 ∶0在新陳代謝過程中的獨特地位，使其在沉積物中具有積聚并且較長時間以較高濃度存在的可能[18]，二是C16 ∶0是長鏈脂肪酸氧化降解的產(chǎn)物[19]。在這兩個過程共同作用下，沉積物中C16 ∶0含量最高現(xiàn)象是合理的。

研究結(jié)果顯示，青蝦擾動作用顯著降低沉積物中FA、SFA、PUFA含量，與Ding等[20]研究結(jié)果類似；孫立群等[18]通過模擬試驗研究刀額新對蝦(Metapenaeusensis)對微藻脂肪酸在沉積物中降解影響時發(fā)現(xiàn)，刀額新對蝦擾動作用能顯著加快藻類中脂肪酸降解。實驗組C16 ∶1含量較空白組存在顯著差異，但MUFA較空白組無顯著差異，與不飽和脂肪酸較飽和脂肪酸更易降解的研究結(jié)論不一致[19]，其原因可能是沉積物及飼料中MUFA含量相對較低、室內(nèi)模擬試驗的局限性等造成的。

3.2 脂肪酸降解參數(shù)

眾多研究表明，沉積物游離態(tài)脂肪酸降解參數(shù)ACL、C20 ∶1-5/C20 ∶0和L/H一定程度上可以反應(yīng)沉積物有機質(zhì)的降解變化[14,15]。短鏈脂肪酸相對于長鏈脂肪酸更易降解[21]，易于降解的短鏈脂肪酸的減少以及長鏈脂肪酸的選擇性富集，導(dǎo)致脂肪酸降解參數(shù)ACL值會隨沉積物有機質(zhì)降解程度的增加而升高[22]。本研究結(jié)果顯示，實驗組ACL明顯大于空白組，這表明青蝦擾動作用促進沉積物有機質(zhì)的降解，與李芳芳[21]研究結(jié)果類似。不飽和脂肪酸的化學(xué)鍵易斷裂，使得沉積物中不飽和脂肪酸含量減少，從而導(dǎo)致C20 ∶1-5/C20 ∶0值的減少[23]。本實驗中L/H以及C20 ∶1-5/C20 ∶0值無顯著差異，未產(chǎn)生差異可能與實驗周期長短、指標適用性和敏感程度不同及室內(nèi)模擬實驗的局限性等因素有關(guān)。

3.3 沉積物理化參數(shù)

青蝦擾動作用能顯著增加沉積物含水率，分析原因是青蝦的攝食、爬行等擾動作用使沉積物表層變得疏松，促進了沉積物-水界面的物質(zhì)交換，使得沉積物有較高的含水量，這與張雷等[24]研究一致。其他研究表明，生物擾動作用能顯著增加沉積物的含水率及總微生物活性，從而促進沉積物中有機質(zhì)的降解[25,26]。實驗組ORP顯著大于空白組，其原因可能是生物體通過攝食和爬行等活動產(chǎn)生的擾動作用可以增加沉積物中的氧含量，提供更多的電子受體，提高沉積物的ORP[27]；吳金浩等[28]研究表明，沉積物ORP與有機質(zhì)含量呈負相關(guān)，即沉積物較強的氧化狀態(tài)是其有機質(zhì)降解的有利條件。本實驗中青蝦擾動作用促使沉積物pH顯著降低，這與李耀睿等[29]研究結(jié)果一致，分析原因可能有以下幾點：較多氧氣進入沉積物后，加速沉積物中有機物的有氧分解，產(chǎn)生較多CO2；沉積物氧化作用提高，硝化作用增強需消耗堿性物質(zhì)，進而導(dǎo)致pH下降；低價金屬(Fe2+和Mn2+)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致沉積物酸化；沉積物釋放的鐵錳離子與OH-的結(jié)合作用大于H+和OH-的結(jié)合作用，因此其水解作用使得沉積物中H+增加，導(dǎo)致pH值較低[30,31,32]。通過相關(guān)性分析，結(jié)合ACL指征作用，青蝦擾動作用顯著提高沉積物MC和ORP，為促進有機質(zhì)降解創(chuàng)造有利條件。

3.4 沉積物碳氮含量

TOC是描述沉積物有機質(zhì)含量的重要指標，C/N除了能有效指示沉積物有機質(zhì)來源外，還能描述沉積物有機質(zhì)分解速度。Nickell等[33]研究表明，C/N低意味著沉積物中含有較高的不穩(wěn)定有機物，其含量的增加有利于有機質(zhì)的礦化反應(yīng)，C/N的變化與有機質(zhì)分解速度之間呈反比關(guān)系[34]。本研究結(jié)果顯示，青蝦擾動作用顯著降低沉積物C/N，增強沉積物中有機質(zhì)的降解程度，與李芳芳[21]研究結(jié)果類似。實驗組與空白組沉積物TN和TOC均無顯著差異，可能與實驗周期較短有關(guān)。青蝦除通過擾動作用改變沉積物微環(huán)境來促進沉積物中有機質(zhì)降解外，其攝食行為也能造成沉積物中有機質(zhì)含量的減少，以及在沉積物表層爬行等活動可能造成沉積物的再懸浮，一些不能被攝食的食物雜質(zhì)會被直接噴射到上層水體中，造成上層水體的渾濁，部分飼料殘餌及少量沉積物也由此轉(zhuǎn)移到上層水體中，Webb等[5]研究生物擾動時發(fā)現(xiàn)底棲甲殼動物能夠擴大溶質(zhì)運輸、加速有機物降解。影響沉積物有機質(zhì)降解的因素除擾動、氧化還原環(huán)境、酸堿度及含水率外，沉積物中礦物含量、顆粒粒徑大小、微生物含量及活性等因素也可能對有機質(zhì)的保存與降解起著重要的控制作用，有待于進一步研究以便更好解釋沉積物中有機質(zhì)的保存與降解機理[35]。

綜上所述，青蝦擾動作用改變了沉積物的MC、ORP等理化指標，為沉積物中有機質(zhì)的降解創(chuàng)造了有利條件。同時，ACL值的差異性也說明青蝦擾動作用可以促進沉積物中有機質(zhì)的降解，從而在一定程度上避免因沉積物中有機質(zhì)過度積累所導(dǎo)致的養(yǎng)殖環(huán)境有機污染的風(fēng)險。但不可忽視的是，實驗組和空白組脂肪酸降解參數(shù)中，L/H與C20 ∶1-5/C20 ∶0指標無顯著差異，可能與實驗周期長短、指標適用性和敏感程度不同等因素有關(guān)，實驗室模擬試驗為下一階段野外實驗時，更好的開展針對性實驗和分析提供寶貴經(jīng)驗。