IGF-1、mtDNA及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平在盆底器官脫垂患者組織表達(dá)研究

陳春經(jīng) 林煥明

【摘要】 目的：研究胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、線粒體DNA（mtDNA）及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ在盆底器官脫垂（POP）患者的組織表達(dá)。方法：收集筆者所在醫(yī)院POP患者50例作為研究組，同時(shí)選擇同期行子宮切除術(shù)的良性非POP患者50例作為對(duì)照組。比較兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對(duì)密度值，以及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。結(jié)果：研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對(duì)密度值分別為（0.41±0.09）、（0.47±0.08）、（0.56±0.11），均低于對(duì)照組的（0.85±0.11）、（0.92±0.13）、（0.93±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值分別為（3.36±0.12）、（5.44±0.18）、（5.16±0.13），均低于對(duì)照組的（4.49±0.14）、（7.17±0.19）、（6.87±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：POP患者宮骶韌帶-子宮主韌帶的mtDNA、膠原蛋白ⅠmRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達(dá)均為下調(diào)趨勢(shì)，可能參與了POP的發(fā)生、發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 盆底器官脫垂 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 線粒體DNA 膠原蛋白Ⅰ 膠原蛋白Ⅲ

[Abstract] Objective： To study the expression of insulin-like growth factor-1 （IGF-1）， mitochondrial DNA （mtDNA） and collagen Ⅰ， Ⅲ in the tissues of patients with pelvic organ prolapse（POP）. Method： A total of 50 POP patients in our hospital were collected as the study group， and 50 benign non-POP patients who underwent hysterectomy at the same time were selected as the control group. The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA and collagen Ⅲ mRNA， and the gray value of IGF-1， collagen Ⅰ protein， collagen Ⅲ protein were compared between the two groups. Result： The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA in the study group were （0.41±0.09）， （0.47±0.08） and （0.56±0.11）， which were lower than （0.85±0.11）， （0.92±0.13） and （0.93±0.12） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The gray values of IGF-1， collagen Ⅰ proteins， collagen Ⅲ proteins in the study group were （3.36±0.12）， （5.44±0.18） and （5.16±0.13）， which were lower than （4.49±0.14）， （7.17±0.19） and （6.87±0.15） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The level of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA and IGF-1， collagen Ⅰ protein， and collagen Ⅲ protein expressions of uterosacral ligament-uterine main ligament in POP patients are all down-regulated， which may be involved in the occurrence and development of POP.

盆底器官脫垂（POP）主要是由于盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷或者退化、損傷及功能障礙所導(dǎo)致，是影響中老年女性生活質(zhì)量的常見疾病。POP的發(fā)病因素復(fù)雜，機(jī)體老化、氧化應(yīng)激在POP的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)過(guò)多的活性氧（ROS）可對(duì)線粒體DNA（mtDNA）造成氧化損傷[2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）作為一促存活因子，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出其抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡的特性[3]。PI3K/AKT信號(hào)通路被認(rèn)為是最主要的促進(jìn)細(xì)胞存活的一條信號(hào)通路[4]，mtDNA、IGF-1、PI3K/AKT信號(hào)通路在維持機(jī)體氧化應(yīng)激/抗氧化應(yīng)激平衡過(guò)程中有著重要作用，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的變化與POP的發(fā)展關(guān)系密切。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)宮骶韌帶-子宮主韌帶復(fù)合體離體IGF-1、mtDNA及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表達(dá)，為防治POP探求新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院2018年1月-2019年3月臨床POP患者50例作為研究組，同時(shí)選擇同期行子宮切除術(shù)的良性非POP患者50例作為對(duì)照組。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：均為已婚已育女性;經(jīng)臨床確診為POP患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：均為已婚已育女性;非POP患者;子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異常增生及宮頸病變患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：婦科惡性腫瘤、妊娠期或哺乳期患者;長(zhǎng)期服用避孕藥、雌激素等激素類藥物者;有既往盆腔手術(shù)史者;吸煙及濫用藥物史者。兩組患者均經(jīng)手術(shù)治療，并獲得宮骶韌帶-子宮主韌帶復(fù)合體離體標(biāo)本。研究組年齡（43.51±10.42）歲;POP分期：Ⅱ期11例，Ⅲ期24例，Ⅳ期15例。對(duì)照組年齡（43.79±9.89）歲;子宮肌瘤25例，子宮內(nèi)膜異常增生18例，宮頸病變7例。兩組患者基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），有可比性。

1.2 方法

兩組均于手術(shù)治療時(shí)取宮骶韌帶-子宮主韌帶復(fù)合體離體標(biāo)本，獲得非POP及POP組織，應(yīng)用定量RT-PCR方法檢測(cè)兩組宮骶韌帶-子宮主韌帶復(fù)合體離體標(biāo)本，檢測(cè)mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA水平的表達(dá)，具體步驟：RNA提取、反應(yīng)體系配制、加RNA模板、RT-PCR反應(yīng)、2.0%瓊脂糖凝膠制備、電泳、RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)，將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察，以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)分析各條帶的相對(duì)密度值。

采用免疫蛋白印記法（western-blot）檢測(cè)兩組標(biāo)本IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白的表達(dá)。主要步驟：SDS-PAGE凝膠制備及灌膠，上樣、電泳、切膠及制備硝酸纖維素膜（PVDF）、轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、加入一抗、二抗，在避光條件下顯影，凝膠掃描成像系統(tǒng)分析，評(píng)估相對(duì)灰度值。

線粒體DNA（mtDNA）核酸檢測(cè)試劑盒（北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司），人IGF-1試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司），人膠原蛋白ⅠmRNA、人膠原蛋白Ⅲ mRNA、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白試劑盒（上?？祈樕锟萍加邢薰荆?凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對(duì)密度值。比較兩組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對(duì)密度值結(jié)果比較

研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA相對(duì)密度值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值結(jié)果比較

研究組IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白灰度值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

盆底支持組織主要包括韌帶、多層肌肉和筋膜，正常子宮位置的維持需要靠子宮韌帶、骨盆底肌和筋膜的共同支托。宮骶韌帶-子宮主韌帶復(fù)合體在盆底支持結(jié)構(gòu)中起最主要支持力量，該韌帶復(fù)合體正常形態(tài)、位置和功能的異常，影響盆底正常功能，可最終導(dǎo)致POP的發(fā)生。妊娠、陰道分娩損傷、肥胖、便秘等多種因素是POP的誘因，盆底支持組織中分子生物學(xué)水平與POP的發(fā)生密切，氧化應(yīng)激、炎性刺激等參與了POP的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[5]。

本次研究結(jié)果顯示，研究組mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、膠原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.05）。線粒體是真核細(xì)胞能量提供和儲(chǔ)存的場(chǎng)所，還在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)POP患者盆底組織中存在mtDNA缺失和重排的累積，且隨著POP程度的加重而明顯累積[6]。mtDNA突變和氧化損傷的累積，促進(jìn)機(jī)體的老化，引起盆底支持結(jié)構(gòu)解剖及功能的異常，最終導(dǎo)致POP的發(fā)生。ROS主要包括超氧陰離子（O2-）、羥基（-OH）和過(guò)氧化氫（H2O2），主要來(lái)源于細(xì)胞中線粒體。隨著年齡的增長(zhǎng)，ROS水平呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而ROS清除機(jī)制卻呈退化趨勢(shì)，二者之間的平衡被打破，氧化應(yīng)激導(dǎo)致mtDNA氧化損傷，引起突變，產(chǎn)生有缺陷的電子傳遞鏈（ETC）組分，導(dǎo)致更多ROS產(chǎn)生和mtDNA突變，引起呼吸鏈有關(guān)蛋白質(zhì)亞單位的合成障礙，形成有缺陷的呼吸鏈，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞ATP合成水平降低和細(xì)胞能量供給不足，致使細(xì)胞損傷[7-8]。

IGF-1的生物學(xué)活性是通過(guò)在胞外區(qū)域與IGF-1受體（IGF-1R）相結(jié)合，然后使跨膜區(qū)的IGF-1R亞基結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起自身磷酸化作用并激活其亞基內(nèi)酪氨酸（Tyr）激酶，促使下游底物發(fā)生一系列的磷酸化，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT等信號(hào)通路，調(diào)整細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[9-10]。PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡有著重要聯(lián)系。PI3K是胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，參與細(xì)胞的能量代謝、增殖、分化及凋亡。AKT的激活，進(jìn)一步激活其下游的分子信號(hào)，以直接或者間接的方式來(lái)調(diào)整細(xì)胞的生存與生長(zhǎng)[11]。隨著年齡的不斷增長(zhǎng)，氧自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡失調(diào)，引起細(xì)胞ROS增加，過(guò)量的ROS進(jìn)入細(xì)胞核導(dǎo)致核內(nèi)DNA損傷，引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。IGF-1可通過(guò)激活PI3K/AkT信號(hào)通路，提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GPx活性，促進(jìn)細(xì)胞ROS的清除[12]。

膠原蛋白含量是決定盆底結(jié)締組織韌性強(qiáng)弱的重要因素，盆底結(jié)締組織中主要含Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是由3條肽鏈組成的一種重要的、基本的蛋白質(zhì)，Ⅰ型膠原蛋白直徑較粗，抗張能力強(qiáng)，起支持作用;Ⅲ型膠原蛋白直徑較細(xì)，柔韌性強(qiáng)。膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平下降，膠原合成代謝發(fā)生紊亂，引起支撐盆腔肌纖維強(qiáng)度降低，影響盆底結(jié)構(gòu)和功能，使其韌性、彈力降低，導(dǎo)致POP的發(fā)生[13]。因此，POP發(fā)生的分子機(jī)制可能是，mtDNA的氧化損傷、IGF-1通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激能力，以優(yōu)化機(jī)體微環(huán)境減緩POP的進(jìn)展，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成降低，導(dǎo)致盆底子宮韌帶形態(tài)、位置和功能的失常。

綜上所述，POP患者宮骶韌帶-子宮主韌帶的mtDNA、膠原蛋白Ⅰ mRNA、Ⅲ mRNA及IGF-1、膠原蛋白Ⅰ蛋白、膠原蛋白Ⅲ蛋白表達(dá)均為下調(diào)趨勢(shì)，可能參與了POP的發(fā)生。

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（收稿日期：2020-01-09） （本文編輯：桑茹南）