照明光源角度不同對顯微拍攝成像的影響

趙萌 陳小貞 李璇 吳文珊

摘要：通過增設(shè)顯微鏡光源，以三種照明角度，對不同表面（光面/糙面/凹凸面）和質(zhì)地（透明/3;透明）的樣品進行拍攝，分析光源不同照明角度對顯微拍攝成像的影響。

關(guān)鍵詞：顯微攝影;光的反射;明場成像;暗場成像

中圖分類號：Q-336 文獻標(biāo)志碼：B

光線照射到物體時，一部分光被物體表面反射（包括鏡面反射和漫反射），另一部分光則穿越物體，被物體吸收或穿過物體透射出去。攝影時，只有進入相機鏡頭的光才能成像，照明光源與相機之間的角度不同，進入相機的反射光和透射光的配比與強度會發(fā)生改變，因此成像效果不同。當(dāng)光源與相機同側(cè)，光源范圍在相機透鏡視野的兩倍以內(nèi)，即光源在“W”區(qū)（明場）之內(nèi)，光柱垂直（或較小的傾斜角度，由于物鏡與被攝體的距離非常接近，故該傾角很?。┱丈涞綐悠返谋砻妫饩€經(jīng)被攝物鏡面反射（發(fā)射光線都朝同一方向）進入相機鏡頭（圖1），成像背景明亮，稱為明場成像：當(dāng)光源在“W”區(qū)之外（稱為暗場），光柱以較大傾角傾斜照射到樣品的表面，鏡面反射光線被反射離開，漫射光（反射光線朝向各個方向）被反射進入照相機（圖1），成像背景灰暗，稱為暗場成像。當(dāng)光源和相機在被攝物的兩側(cè)，光柱穿過被攝物（必須是透明的）后的透射光進入相機鏡頭（圖1），背景明亮，形成強對比度成像，亦為明場成像，成像主要為被攝物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。由于普通光學(xué)顯微鏡的放大倍率是體視顯微鏡的5-10倍，且分辨率高，因此，下面通過增設(shè)普通光學(xué)顯微鏡的照明光源，以薜荔榕小蜂（Wiebesia pumilae）幼蟲和榕小蜂Sycophila sp.（早）成蟲（小于5mm的微小樣品）為例，探究照明光源角度不同對顯微拍攝成像的影響。

1光源設(shè)置

分別設(shè)置了三種光源：①上光源，自制小型冷光源陰極環(huán)形燈，通過旋鈕套扣在物鏡上，使光線從上方垂直照射被攝樣品;②側(cè)光源，利用臺式ULP-301-SL可移動LED冷光源，從顯微鏡載物臺的兩側(cè)（與物鏡間的夾角為80°）照射被攝樣品;③下光源，為顯微鏡配套的光源。利用奧林巴斯BX51顯微鏡進行分層拍攝，通過景深擴展軟件進行圖像合成。

2成像效果對比

薜荔榕小蜂幼蟲為光面透明的樣品，利用上/側(cè)光源拍攝光面樣品均易產(chǎn)生鏡面反射，即成像時，在樣品表面產(chǎn)生塊狀或環(huán)狀，稱之為“高光”的特亮區(qū)域（圖封三A），看不到該區(qū)結(jié)構(gòu)，成像為白色，但高光區(qū)又是被攝體成像具立體感不可或缺的要素。利用上光源拍攝小蜂幼蟲，由于物體表面的鏡面反射，大量反射光進入鏡頭，故表面結(jié)構(gòu)成像細(xì)膩豐富，產(chǎn)生的形變小，成像立體感強（圖封三A）;利用側(cè)光源拍攝時，光線傾斜照射蟲體，大量鏡面反射光逸出鏡頭，進入鏡頭的多為漫反射光，因此成像均勻，但樣品表面細(xì)節(jié)特征成像模糊，立體感較弱。由于一部分光線透過蟲體，被吸收或形成透射光進入鏡頭，因此幼蟲內(nèi)部中腸的結(jié)構(gòu)和位置較為清晰（圖封三B）。

下光源只能拍攝透明的樣品，光線經(jīng)樣品透射后進入鏡頭，成像平面化，無立體感，背景明亮，光比（不同區(qū)域間的明暗差異）大。成像色彩取決于樣品對光的吸收和透射：未吸收光的部位（即光全部透過），例如體壁，成像為高光區(qū)（白色）;不透光的部位，例如幼蟲骨質(zhì)的口器，成像為暗區(qū)（黑色）。幼蟲中腸將黃色以外的色光吸收，僅黃色光透過，故在成像中呈現(xiàn)黃色（圖封三C）。

榕小蜂成蟲為不透明樣品，但由于頭（眼）、胸、腹和翅各部分的表面結(jié)構(gòu)不同，成像效果也各不相同。

（1）上光源照明在半球形復(fù)眼（糙面）上形成柔和的頂面環(huán)形明區(qū)，在視覺上復(fù)眼顯得較為扁平（圖封三D1）;在側(cè)光源照明下，復(fù)眼的兩側(cè)面形成明區(qū)，暗區(qū)與明區(qū)的光比大且逐漸過渡，層次豐富，故此時復(fù)眼成像在視覺上較為立體（圖封三E1）;在拍攝表面粗糙、質(zhì)地透明的樣品（如莖葉徒手切片）時，成像效果與此相同。

（2）若糙面起伏較大形成凹凸不平狀，如小蜂胸部在上光源照明下的成像明亮、均勻、柔和，明區(qū)和暗區(qū)間的光比小，昆蟲體表的細(xì)節(jié)特征全面，但立體感差（圖封三D1）;側(cè)光源照明下的小蜂胸部成像光比大，通常是最亮的區(qū)域曝光過度形成白色高光斑，而最暗的區(qū)域因曝光不足難以成像，因此，雖立體感強，但曝光度難以調(diào)節(jié)。如側(cè)光源照明中位于暗區(qū)的觸角，毛形觸角感覺器成像缺乏細(xì)節(jié)特征，甚至連分節(jié)都十分模糊（圖封三E1）。

（3）光面樣品在上光源和側(cè)光源照明下都會產(chǎn)生高光斑，但上光源形成的高光斑通常面積較大，如小蜂的腹部光滑，上光源照射時形成的環(huán)形高光斑易造成腹部凹陷的錯覺（圖封三D1）。

（4）小蜂的膜翅，平面、透明具光澤，附著在蟲體上的翅，因懸空并與照明光線成一定角度，翅的反射光和透射光均可進入鏡頭，不同光線之間的干擾，使光澤難以成像。若將翅取下單獨拍攝，在上光源照明下，由于進入鏡頭的反射光多，翅的彩色光澤展示得充分（圖封三D2，尤其在黑色背景下，去除了透射光的干擾，色彩更為艷麗），側(cè)光源照明則顯得暗淡無光澤（圖封三E2）。

綜上所述，成像效果不僅與照明光源的角度有關(guān)，也與被攝樣品的表面結(jié)構(gòu)（光面/糙面/凹凸面）、立體結(jié)構(gòu)（平面，立體），以及質(zhì)地（透明度）有關(guān)，光源、樣品、成像效果之間的相關(guān)性見表1。