廬江湯池溫泉中首個嗜熱菌的分離鑒定及特性研究

張鳳琴

（巢湖學院化學與材料工程學院，安徽巢湖238000）

嗜熱菌是一類最適宜生長溫度高于50°C，最低生長溫度不低于30°C，最高生長溫度在60°C以上的極端環(huán)境微生物[1-2]。對嗜熱菌的研究，國外起步較早，在美國、冰島、俄羅斯及新西蘭等地均有大量嗜熱菌的分類種群被發(fā)現(xiàn)[3-5]。近幾年來，國內在嗜熱菌研究領域也有不少收獲，在云南、廣州、四川、福建、臺灣和江西等地的多處溫泉中有一些嗜熱菌被分離鑒定[6-8]。嗜熱菌因其超強的耐熱性和獨特的生理生化特性，在生物科學研究及工業(yè)生產領域都有著獨特的作用[9]，嗜熱菌產生的嗜熱酶及其菌體均具有很廣闊的應用前景。嗜熱菌的嗜熱酶在高溫下具有很強的穩(wěn)定性，可用于需要高溫催化的食品、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護、能源等領域，如嗜熱脂肪芽孢桿菌產生的高溫α-淀粉酶可使淀粉完全轉化為右旋葡萄糖，嗜熱酶可生產新型藥物，嗜熱酶可降解芳香族化合物、氰化物、有機磷農藥等難降解物質，嗜熱菌產生的纖維素酶在乙醇發(fā)酵中，可提高乙醇產量。嗜熱菌菌體可直接用于工業(yè)中，如硫化細菌可用于硫化礦的生物瀝濾和煤炭的脫硫過程[10]。

廬江湯池地熱資源豐富，嗜熱菌研究潛力大，但目前仍未見對廬江地區(qū)嗜熱菌的研究報道。本研究從廬江湯池溫泉水（約60 ℃，pH 7.0）中分離嗜熱菌，對分離得到的嗜熱菌進行分子生物學鑒定、形態(tài)學特征和生理生化特性研究，為其在以后的科學研究及工業(yè)應用提供理論支持和物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集于廬江湯池溫泉，東經117°01′、北緯31°33′。細菌DNA 提取試劑盒和PCR 膠回收試劑盒，購自大連TaKaRa公司；引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L，調節(jié)pH 至7.2～7.4（固體培養(yǎng)基添加瓊脂14.0 g/L）。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等藥品均為國產生物級。

1.2 方法

（1）嗜熱菌分離純化

取（0.2～0.3）mL溫泉水，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，60°C下恒溫培養(yǎng)24 h。經過反復多次純化直至得到單菌落。

（2）菌株的分子生物學鑒定

菌株基因組DNA 的提取參照細菌DNA 試劑盒（大連TaKaRa 公司）操作。采用細菌通用引物擴增16S rRNA 基因序列并對產物進行測序（上海生工生物工程有限公司）。將測序結果與GenBank中已報道的序列進行比對，并用MEGA6的Neighbor joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定菌株的系統(tǒng)分類地位。

（3）菌株的形態(tài)觀察

將純化菌株用平板劃線法接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，60°C恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落生長情況、形態(tài)、大小、表面、邊緣及顏色等各方面特征。挑取單菌落，對其進行革蘭氏染色，通過光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)和革蘭氏分析。

（4）生理生化特性研究

生化特性鑒定。通過非發(fā)酵細菌生化鑒定管對菌株的生化特性進行鑒定。該試驗選用的非發(fā)酵細菌生化鑒定管共包含14 個生化鑒定項目：精氨酸（Arginine）、鳥氨酸（Ornithine）、賴氨酸（Lysine）、氨基酸對照（Amino acid control）、枸櫞酸鹽（Citrate）、硝酸鹽還原作用（Nitrate reduction）、尿素（Urea）、七葉苷（Esculin）、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、蔗糖（Sucrose）、麥芽糖（Maltose）、木糖（Xylose）、葡萄糖（Glucose）、硫化氫（Hydrogen sulfide）和氧化酶（Oxidase）。

不同pH下的生長情況。將菌液接種于pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中。于60°C、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h。通過分光光度計測定菌體濃度，從而確定菌株生長的pH 范圍及最適宜pH。

最高耐受溫度的確定。取（0.2～0.3）mL菌液，涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，分別于60、65、70、75、80°C生長24 h，觀察菌株生長情況，初步確定菌株最高耐受溫度范圍。確定范圍后，再在范圍內以1°C為間隔，確定菌株具體的最高耐受溫度。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與純化

從湯池溫泉水中分離純化得到一株嗜熱菌，命名為LJTC-1（NCBI登錄號：KT454966）。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

通過PCR擴增得到菌株LJTC-1的16S rRNA基因片段，將擴增產物測序后與GenBank中已報道的序列進行比對，并將序列上傳至GenBank（接受號：KT454966）。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）與進化關系比較親近的屬種進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，得知菌株LJTC-1屬于Thermoactinomyces屬，且與Thermoactinomycessp.60X-8(JN578486.1)親緣關系最親近，二者在同一個進化分支上。

圖1 LJTC-1菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 菌株的形態(tài)特征

LJTC-1菌落形態(tài)為白色、不透明、圓形、邊緣不規(guī)則、表面隆起、干燥、似毛狀、直徑在（3.0～5.0）mm，如圖2（a）所示。菌體經革蘭氏染色后鏡檢，LJTC-1菌呈鏈珠狀，革蘭氏陽性菌，如圖2（b）所示。

圖2 菌株LJTC-1的菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢圖片

2.4 生理生化特征

（1）生理生化特性鑒定

菌株LJTC-1 在精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、氨基酸對照、枸櫞酸鹽、尿素、OPNG 及氧化酶試驗中呈陽性；在硝酸鹽還原反應、七葉苷、硫化氫試驗中呈陰性（見表1）。

表1 生理生化特征

（2）最適宜pH

初步測定菌株LJTC-1可生長的pH范圍為5.5～9.0，最適宜pH約為7.5，如表2和圖3所示。

表2 不同pH下菌株生長情況

圖3 pH對菌株的影響

（3）最高耐受溫度

通過初步實驗確定菌株LJTC-1在（60～70）°C可生長，在75 ℃以下無法生長，如表3所示。由表3可確定該菌株最高耐受溫度范圍為（70～75）℃，為了進一步確定耐受溫度，將該菌株放于71、72、73和74 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)結果如表4所示。在74 ℃時菌株仍能生長，而75 ℃不生長，故確定其最高耐受溫度為74 ℃。

表3 不同溫度下菌株生長情況（Ⅰ）

表4 不同溫度下菌株生長情況（Ⅱ）

3 討 論

從研究結果可知，菌株LJTC-1 與Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）親緣關系最親近，Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）菌在（15～40）℃范圍內可生長[11]，而該菌最高耐受溫度為74 °C。由此推測廬江湯池地區(qū)獨特的地理條件和溫泉環(huán)境可能對造成菌株LJTC-1與親緣關系相近菌株間差異起到一定作用。

目前，分離得到的嗜熱菌最高耐受溫度多為（65～72）℃[12-14]，但Balwinder SS從垃圾堆放處篩選得到能耐受90 ℃高溫的嗜熱菌Geobacillus[4]，這可能與采樣點的高溫環(huán)境有關。嗜熱菌對高溫具有獨特的適應機制，主要與細胞膜、蛋白質與遺傳物質有關。嗜熱菌的膜脂具有長鏈和高飽和度的脂肪酸，能形成很強的疏水鍵，從而使細胞膜在高溫環(huán)境下保持正常的生理功能[15-16]；嗜熱菌蛋白質穩(wěn)定的天然結構和細胞內的促進熱穩(wěn)定因素，即嗜熱菌蛋白質的熱穩(wěn)定性是其耐熱性的主要機制[17]；此外，嗜熱菌DNA結構中G+C%含量較高且螺距較短，有利于DNA的穩(wěn)定，嗜熱菌tRNA周轉速度快且其G+C%含量高，因此其tRNA在高溫下的穩(wěn)定性較好，故嗜熱菌的耐熱性與其遺傳物質的穩(wěn)定性有關[18-19]。

安徽廬江湯池地區(qū)地熱資源豐富，開發(fā)潛力大。但目前仍未有關于廬江湯池地區(qū)的嗜熱菌研究，此研究是第一篇關于廬江湯池溫泉中嗜熱菌的文章，所分離鑒定的菌株LJTC-1是目前唯一一株從廬江湯池溫泉中分離得到的嗜熱菌。該研究結果可以為當?shù)卣畬]江湯池溫泉資源保護和開發(fā)利用提供理論支持，并為其在以后的科學研究及工業(yè)應用方面提供參考。后續(xù)將對該菌的高溫酶進行特性研究并對其結構進行分析，找出其與親緣關系相近菌株高溫酶之間的差異，并對嗜熱菌和其高溫酶的應用進行研究，通過分子生物學手段將嗜熱酶在性狀更優(yōu)良的微生物中進行克隆表達[20]。