一種高效的白樺樹皮中白樺脂醇分離、純化方法

李 影 李林夕 張玉琦 王 宇 詹亞光,2 尹 靜,2*

(1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.林木遺傳育種與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是樺木科(Betulaceae)樺木屬(BetulaLinn.)植物，為耐寒落葉喬木[1]。其樹皮成分復(fù)雜，藥理活性多樣，早在李時(shí)珍《本草綱目》中就有記載，樺木皮可用來治療黃痕、濟(jì)疫、乳癰、止咳治急、慢性痢疾等疾病[2～3]。近年來研究顯示，白樺樹皮提取物白樺三萜物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、利膽和保肝等重要作用,抗瘧疾、消炎和抗腫瘤活性,尤其在抗艾滋病病毒活性及抗各種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞毒性[4～5]，高效低毒，被認(rèn)為是最具潛力的藥物先導(dǎo)化合物。白樺樹皮三萜主要成分白樺脂醇和白樺脂酸的抗炎性已在體外和體內(nèi)模型體系中被驗(yàn)證，主要通過對(duì)非神經(jīng)基因路徑的抑制來達(dá)到，也可能是由于白樺脂酸與糖皮質(zhì)激素受體相互作用[6～7]。白樺脂醇可以抑制AC16心肌細(xì)胞炎癥通路NF-κB和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[8],對(duì)酒精性肝損傷有較好的治療作用[9]，能夠緩解體力疲勞和提高缺氧耐受力的作用[10]；同時(shí)白樺脂醇可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過提高Col合成及相關(guān)蛋白酶的表達(dá)等途徑起到對(duì)皺紋修復(fù)的作用。另有研究表明，白樺脂醇具有抗抑郁、抗焦慮作用，并具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用[11～12]。

1788年，Lowit首次報(bào)道白樺樹皮中含有白樺脂醇，并將其分離出來。自此，有關(guān)白樺中其他化學(xué)成分的研究陸續(xù)被報(bào)道。白樺脂醇在樺樹皮中的含量為10%～35%，主要以晶狀沉積物的形式在白樺樹皮外層中存在，白樺樹皮之所以是白色也是因?yàn)榘讟逯紟缀醭錆M了它的表皮細(xì)胞的內(nèi)部空間。白樺脂醇在白樺不同部位的含量分布差異顯著，依次為：外皮>枝皮>內(nèi)皮>芽>葉>根>花粉[13]。目前，實(shí)驗(yàn)室和工廠提取的白樺脂醇大多是來自植物，例如白樺中直接提取，提取的方法也是多種多樣，三萜化合物(不包括皂苷)沒有一個(gè)統(tǒng)一的提取方法[14]，實(shí)踐生產(chǎn)中難以選擇使用。從白樺樹皮中制備白樺脂醇一般可分為兩大步，即溶劑回流提取和重結(jié)晶提純。祁逸梅[15]等提取白樺脂醇，用乙醇溶液加熱回流大約5 h，將提取液減壓蒸餾之后用乙醇重結(jié)晶2～3次，初提物用甲醇/氯仿(1∶1)重結(jié)晶，得到白色針狀的白樺脂醇固體。盧福強(qiáng)等[16]將白樺樹皮粉碎，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，過硅藻土柱，使用乙酸乙酯洗脫，洗脫液回收乙酸乙酯至干，加入15倍95%乙醇過濾，干燥，干燥樣品中白樺三萜類物質(zhì)含量在98%以上。栗巧云[17]使用D101型大孔吸附樹脂對(duì)白樺三萜分離純化，結(jié)果表明，其干燥品中白樺脂酸類三萜化合物含量可達(dá)74.27%。除此之外，白樺脂醇的提取還有超臨界二氧化碳萃取和超聲輔助提取等[18～19]。綜上所述，白樺脂醇的提取和純化方法較多，但沒有一種公認(rèn)的效率高、純度高的統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，實(shí)踐中難以選擇。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)上述方法進(jìn)行綜合、比較、優(yōu)化，以期篩選最佳的白樺脂醇提取、純化的方法，為白樺脂醇類產(chǎn)物進(jìn)一步充分利用提供一種高效、簡(jiǎn)便的提取純化的方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

白樺樹皮來自東北林業(yè)大學(xué)約50年樹齡白樺植株外皮。

1.2 白樺脂醇提取方案比較

將5.00 g干燥后的白樺樹皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入錐形瓶中，按照以下3種提取方案進(jìn)行白樺脂醇的提取。

方案一：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL：g)浸泡24 h(對(duì)照組)、72、120、168 h；超聲振蕩5 min，用濾紙過濾，收集濾液；濾液50℃加熱回流5 h；常壓，用坩堝50℃水浴蒸餾，得到粗提物。

方案二：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h；超聲振蕩15 min，用濾紙過濾，收集濾液。取消超聲振蕩為對(duì)照組；濾液50℃加熱回流5 h；50℃減壓蒸餾至圓底燒瓶剩少許，此時(shí)為了防止產(chǎn)物被吸出，換坩堝在常壓水浴50℃蒸干，得到粗提物。

方案三：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，過濾，濾渣用8倍量95%乙醇回流提取3 h，合并濾液；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濾液中的乙醇。得到濃縮后的粗提物液體；過濾，常壓50℃水浴蒸干，得到粗提物。

1.3 白樺脂醇的重結(jié)晶

根據(jù)上述1.2所得優(yōu)化提取方案，選擇將15 g干燥的白樺樹皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入錐形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后過濾，將濾液50℃加熱回流5 h，減壓蒸餾，將液體轉(zhuǎn)移到坩堝中繼續(xù)蒸干，得到初提物，待重結(jié)晶使用，重結(jié)晶采用下述3種方法。

1.3.1 甲醇—氯仿重結(jié)晶法

將提取液減壓蒸餾之后用乙醇重結(jié)晶3次，再用甲醇/氯仿(1∶1)重結(jié)晶，1 g粗產(chǎn)品需要40 mL的甲醇—氯仿溶液；靜置過夜；抽濾，得到白色針狀的白樺脂醇固體。

1.3.2 無水乙醇重結(jié)晶法

以70 mL乙酸乙酯為溶劑，加熱回流90 min，趁熱過濾。濾液使用坩堝50℃濃縮至干。以無水乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，無水乙醇∶固體=30 mL∶1 g，-20℃重結(jié)晶。室溫下過濾、50℃烘干。

1.3.3 吸附層析法

使用D101型大孔吸附樹脂吸附層析，使用乙酸乙酯洗脫，洗脫液回收乙酸乙酯至干，加入15倍無水乙醇加熱溶解，0℃以下冷沉，過濾，干燥。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)提取物中白樺脂醇的含量

分別取0.10 g以上3種重結(jié)晶方法得到的提取物，加入適量的甲醇使其完全溶解。分別取2 mL溶解液，利用0.45 μm有機(jī)濾膜濾過，作為樣品檢測(cè)液。以1 mg·mL-1的白樺脂醇標(biāo)品作為對(duì)照，利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件：用Waters公司1525-2707-2489色譜系統(tǒng)，色譜柱HiQ sil C18V 4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相為乙腈∶水=9∶1(V∶V)；柱溫25℃；靈敏度16 AUFS；進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

白樺脂醇回歸方程為:y=(x-68 020)*10^-6/9,R2=0.999 4。結(jié)果表明，白樺脂醇在0.2～5.0 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺脂醇的提取方法比較

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)白樺脂醇含量提取的影響

根據(jù)方案一，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸提，探討不同浸泡時(shí)間對(duì)白樺脂醇提取含量的影響。將浸泡時(shí)間分別延長(zhǎng)為72、120和168 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，浸提24 h為對(duì)照。除浸泡時(shí)間不同外，其他操作均相同。

分析結(jié)果表明(見圖1)，適當(dāng)延長(zhǎng)的浸泡時(shí)間有利于粗提物產(chǎn)量的提高，當(dāng)浸泡時(shí)間為120 h時(shí)，白樺樹皮(5.00 g干樣)粗提物產(chǎn)量顯著提高，為1.00 g，初提物產(chǎn)率為20%。而當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至168 h，粗提物的產(chǎn)量并無提升，可能有所降解。表明白樺樹皮回流提取前最佳浸泡時(shí)間為120 h。

圖1 不同浸泡時(shí)間對(duì)白樺脂醇初提物的產(chǎn)量的影響Fig.1 The effect of different soaking time on the yield of the initial extract of betulin

圖2 超聲振蕩對(duì)白樺脂醇初提物產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic oscillation on yield of the initial extract of betulin

2.1.2 超聲振蕩對(duì)白樺脂醇提取的影響

根據(jù)方案二，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h。超聲振蕩15 min，頻率40 Hz，對(duì)照為不進(jìn)行超聲處理。超聲振蕩與否對(duì)白樺樹皮粗提物的產(chǎn)量并無顯著影響，可能的原因是120 h的充分浸提時(shí)間足以保證粗提物的獲得。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)由于超聲振蕩使得白樺樹皮的浸提物變得渾濁給過濾增加了困難，延長(zhǎng)了過濾的時(shí)間(如圖2所示)。

2.1.3 利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濾液中的乙醇對(duì)白樺脂醇產(chǎn)量影響

根據(jù)方案三，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，過濾，濾渣用8倍量95%乙醇回流提取3 h，合并濾液。再使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濾液中的乙醇。得到濃縮后的粗提物液體。過濾并在50℃水浴蒸餾至干，得到初提物0.81 g，提取率為16.2%。

通過上述3種方案的比較，白樺樹皮最佳浸泡時(shí)間為120 h；此后不再需超聲振蕩，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀可以大大縮減蒸餾的時(shí)間，回收提取液，節(jié)約環(huán)保。所以，確定白樺脂醇回流提取的最佳方案為：將5 g干燥的白樺樹皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入錐形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后，過濾，將濾液50℃加熱回流5 h，減壓蒸餾，得到初提物固體約1 g，提取率為20%。

2.2 白樺脂醇的重結(jié)晶方法比較

根據(jù)上述2.1所得的結(jié)果，我們選擇將15 g干燥的白樺樹皮剪成近似1 cm的方形碎片，按照2.1中所述的最佳白樺脂醇提取方案得到初提物固體3.21 g。

2.2.1 甲醇—氯仿重結(jié)晶法

將0.50 g初提物用乙醇重結(jié)晶3次，得到白樺脂醇的粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品再用甲醇/氯仿(1∶1)重結(jié)晶，1 g粗產(chǎn)品約需40 mL的甲醇和氯仿溶液。靜置過夜，抽濾，得到白色針狀的固體0.04 g(圖3A)，重結(jié)晶率為8%。使用此法提取得到的白色粉末狀物質(zhì)，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2.2 無水乙醇重結(jié)晶法

將0.50 g初提物以70 mL乙酸乙酯為溶劑，加熱回流90 min，趁熱過濾。濾液使用坩堝50℃濃縮至蒸干。以無水乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，無水乙醇(mL)∶固體(g)=30∶1。使用無水乙醇15 mL，-20℃重結(jié)晶。室溫下過濾、50℃烘干。得到白色粉末狀的白樺脂醇固體0.19 g(圖3B)，重結(jié)晶率為38%。

2.2.3 大孔吸附樹脂層析法

將0.50 g初提物使用D101型大孔吸附樹脂吸附層析，使用乙酸乙酯洗脫，洗脫液回收乙酸乙酯至干，加入15倍無水乙醇加熱溶解，0℃以下冷沉，過濾，干燥。得到奶白色固體粉末0.4 g。重結(jié)晶率為80%(圖3C)。

圖3 3種重結(jié)晶方法得到的白樺脂醇粉末 A～C分別為甲醇—氯仿重結(jié)晶法，無水乙醇重結(jié)晶法和吸附層析重結(jié)晶法得到的產(chǎn)物。Fig.3 Powdery substance of betulin obtained by three recrystallization methods A-C are respectively methanol-chloroform recrystallization,anhydrous ethanol recrystallization and adsorption chromatography recrystallization.

表1 白樺脂醇初提物重結(jié)晶的產(chǎn)量及產(chǎn)率

Table 1 Yield and yield of recrystallization of the initial extract of betulin

白樺脂醇產(chǎn)量Production of betulin(g)白樺脂醇產(chǎn)率Yield of betulin(%)甲醇—氯仿Methanol-chloroform0.040.8無水乙醇Absolute ethanol0.1938吸附層析Adsorption chromatography0.4080

圖4 白樺脂醇初提物重結(jié)晶的產(chǎn)量Fig.4 Productivity of recrystallization of the initial extract for betulin

初提物重結(jié)晶的產(chǎn)量及產(chǎn)率計(jì)算結(jié)果顯示(見圖4)，利用D101型大孔樹脂吸附層析得到的提取物產(chǎn)率最高，為80%。其次是利用無水乙醇重結(jié)晶法得到的提取物，為38%。產(chǎn)率最低的是甲醇—氯仿重結(jié)晶法，為8.0%。

2.3 高效液相色譜檢測(cè)

2.3.1 HPLC檢測(cè)提取物種類

HPLC的結(jié)果顯示，白樺脂醇標(biāo)品在8.714 min出峰，通過甲醇—氯仿重結(jié)晶法純化得到的產(chǎn)物有5個(gè)峰，白樺脂醇占36.07%；通過無水乙醇重結(jié)晶法純化得到的產(chǎn)物有3個(gè)峰，白樺脂醇占66.49%；通過吸附層析法純化得到的產(chǎn)物有7個(gè)峰，白樺脂醇含量占58.71%。由此可知，通過無水乙醇重結(jié)晶法純化得到的產(chǎn)物雜質(zhì)種類較少，且白樺脂醇的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雜質(zhì)的含量。

圖5 白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品Fig.5 Betulin standard

圖6 甲醇—氯仿重結(jié)晶得到白樺脂醇Fig.6 Betulin obtained by recrystallization of methanol-chloroform

圖7 無水乙醇重結(jié)晶得到白樺脂醇Fig.7 Betulin obtained by recrystallization of absolute ethanol

圖8 吸附層析法重結(jié)晶得到白樺脂醇Fig.8 Betulin obtained by recrystallization from adsorption chromatography

2.3.2 HPLC檢測(cè)提取物中白樺脂醇的含量

稱取利用無水乙醇重結(jié)晶法得到的提取物，溶于10 mL甲醇中，提取物溶液濃度為1.13 mg·mL-1，標(biāo)為T1；從中取出1 mL裝于試管中再用甲醇稀釋10倍，此時(shí)提取物溶液濃度為0.113 mg·mL-1，標(biāo)為T2；從中取出1 mL裝于試管中再用甲醇稀釋10倍，此時(shí)提取物溶液濃度為0.0113 mg·mL-1，標(biāo)為T3。上述T1、T2、T3液體用HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示，利用無水乙醇重結(jié)晶法純化得到的白樺脂醇的純度在94.9%以上，最高純度可達(dá)99.80%以上(詳見表2)。同時(shí)通過此法也能獲得較高純度的白樺脂醇的下游產(chǎn)物白樺脂酸(見圖7)，可作為進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)品使用。

表2 HPLC檢測(cè)提取物中白樺脂醇的含量及純度

Table 2 Determination of the content and purity of betulin in extract by HPLC

名稱Name面積(微伏·秒)Area(miV·s)含量Content(mg·g-1)純度Purity白樺脂醇Betulin(0.5mg·mL-1)3103434/1T19719680949.032448494.90%T21083504985.191740498.51%T3168214998.509341299.80%

3 討論

白樺脂醇及其衍生物具有重要的抗腫瘤和抑制艾滋病毒活性，關(guān)于其來自白樺樹外皮的提取和純化的方法成為其實(shí)踐應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。李正華[20]以100%乙醇70℃超聲波(40 Hz,150 W)提取白樺樹皮樣品60 min，提取含量在14.51%～17.56%，優(yōu)點(diǎn)是提取方法簡(jiǎn)便，但得率稍低；丁為民[21]利用超臨界二氧化碳流體萃取法提取白樺脂醇，平均提取率可達(dá)到23.33%，純度達(dá)到55.77%；利用無水乙醇，在液固比(mL∶g)為30∶1的條件下，進(jìn)行重結(jié)晶，白樺脂醇的純度均大于95%，最高可達(dá)98.13%，重結(jié)晶得率為26.61%～34.00%；周宏建[22]用乙醇作提取劑，固液比(g∶mL)為0.083,抽提時(shí)間6 h，分別用異丙醇和乙醇作溶劑，通過兩步重結(jié)晶操作，得到白樺脂醇的產(chǎn)率達(dá)19.8%，純度達(dá)98%，但重結(jié)晶產(chǎn)率較低；張靜[23]等采用亞臨界提取法，亞臨界提取壓力6 MPa、130℃、液固比(mL·g-1)為40∶1、提取時(shí)間12 min得到白樺脂醇最佳得率為3.09%，初提物得率較低，可能與提取時(shí)間較短有關(guān)；馮亞亞[24]利用乙酸乙酯、77℃、料液比1∶20，提取7 h，得率為22.8%，純度為83.43%；趙國(guó)玲[25]利用氯仿/NaOH兩相溶劑提取法，得率為14.32%，純度可達(dá)到91.89%。

本研究綜合比較上述提取、純化的方法，獲得了白樺脂醇提取的最佳方案。即將5.00 g干燥的白樺樹外皮剪成近似1 cm的方形碎片(白樺樹最外皮白色薄皮，直徑1～2 mm，大量取材時(shí)建議進(jìn)一步采用白樺樹皮粉碎成粉末再提取白樺脂醇等三萜物質(zhì))，放入錐形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后，用濾紙過濾，收集濾液，將濾液50℃加熱回流5 h，減壓蒸餾約3 min，蒸餾燒瓶中剩余些許液體，將液體轉(zhuǎn)移到坩堝中繼續(xù)蒸干，得到米白色固體1.00 g。接著以70 mL乙酸乙酯為溶劑，將得到的固體加熱回流90 min。濾液使用坩堝50℃濃縮至干。再以無水乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，無水乙醇∶固體=30 mL∶1 g，-20℃重結(jié)晶，重結(jié)晶得率可達(dá)38.00%。室溫下過濾后50℃烘干，最終得到白色固體，即為白樺脂醇，純度在94.90%以上，最高可達(dá)到99.81%。這種優(yōu)化后的白樺脂醇提取方案，同以往的提取方法相比，獲得的產(chǎn)物純度更高，產(chǎn)量也較高，而且操作簡(jiǎn)單，試劑毒性低，所用儀器較為常見，方便安全，為進(jìn)一步的規(guī)?；崛“讟逯技鞍讟逯己桶讟艴ニ岬臉?biāo)準(zhǔn)品的獲得提供了一種方便、安全、有效的方法。