不同軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚遷移量的檢測和評價(jià)分析

秦燕飛，孫建平，陳佳威，梁蒙，任艷文

（中國長城葡萄酒有限公司技術(shù)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部釀酒葡萄加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北懷來 075400）

軟木塞污染是葡萄酒最嚴(yán)重的感官缺陷之一，造成軟木塞污染的主要成分就是具有強(qiáng)烈泥土/發(fā)霉氣味的2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）[1-2]。TCA是由一類生長在軟木塞內(nèi)的霉菌分解其生長環(huán)境中的2,4,6-三氯苯酚而產(chǎn)生的物質(zhì)[3-4]。瓶裝后，經(jīng)木塞遷移到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身還穩(wěn)定，而且痕量（2～10 ng/L）的TCA便會產(chǎn)生令人不悅的氣味[1,5-6]，同時(shí)也會干擾消費(fèi)者對其他香氣成分的感知。美國食品藥品監(jiān)督管理局的研究報(bào)告表明，TCA的閾值水平一般是3.1 ng/L[7]。根據(jù)測算，全球每年因TCA污染而造成的葡萄酒損失可達(dá)100億美元[8]。

雖然葡萄酒界也在致力于尋找軟木塞的替代者，如高分子材料合成塞、玻璃塞、鋁制螺旋帽等[9]，但它們在一定程度上缺少了葡萄酒長期熟成的有益性和開瓶時(shí)的高級感。因此，目前軟木塞仍然是理想的葡萄酒瓶塞。按材料或加工工藝可將軟木塞分為：天然塞（含填充塞）、貼片塞（1+1塞、0+1塞、2+2塞等）、聚合塞、加頂塞[10]，在此基礎(chǔ)上又衍生出微顆粒塞、DIAM塞等[11-12]。

TCA在軟木塞和葡萄酒中的含量都非常低，因此，高效的前處理萃取技術(shù)和靈敏度極高的檢測方法是必不可少的。前處理方法有固相微萃取、液液微萃取和免疫親和固相萃取等[5-6,13]，其中以頂空固相微萃取的使用為主。儀器檢測方法有氣相色譜-電子捕獲檢測器法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及其他檢測方法（如離子流動性光譜法、酶聯(lián)免疫分析法等）[5-6,14-15]，其中以氣相色譜-電子捕獲檢測器法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的使用為主。目前，對于木塞中TCA的研究多為萃取技術(shù)、檢測方法的優(yōu)化，不同類別軟木塞中TCA的遷移量及相應(yīng)規(guī)律卻鮮有報(bào)道。

本研究采用ISO 20752-2014[16]國際通用的檢測方法，即HS-SPME-GC-MS（頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）法對軟木塞中TCA遷移量進(jìn)行檢測，在建立了成熟穩(wěn)定的檢測方法基礎(chǔ)上，對不同廠家、不同類別的軟木塞進(jìn)行TCA遷移量的檢測和評價(jià)分析，旨在對葡萄酒封裝中軟木塞的選擇提供指導(dǎo)，最大程度上降低軟木塞中TCA對葡萄酒的污染。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用軟木塞來自8家不同木塞生產(chǎn)廠和貿(mào)易公司，采樣時(shí)間2018年1月—2019年12月，每批次樣品取樣40個(gè)，密封包裝后備用。

1.2 試劑與儀器

按照國際ISO方法[16]測定樣品中TCA含量。

1.2.1 試劑

本方法使用符合GB/T 6682規(guī)定的一級水；四無乙醇（色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇和氯化鈉均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）標(biāo)品，純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）-D5標(biāo)品，純度≥98%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh。

1.2.2 儀器

島津氣相色譜-質(zhì)譜連用儀（GC-MS 2010Ultra）；SPME固相微萃取裝置；100μm PDMS SPME萃取頭（安譜公司）；低極性石英毛細(xì)管柱：長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25μm；固定相為5%二苯基和95%二甲基聚硅氧烷共聚物（RESTEK）；島津不分流、無石英棉襯管；高純氦氣；分析天平：感量 0.01 mg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

12%（V/V）乙醇溶液用無水乙醇配制。TCA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、TCA-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制參照ISO方法[16]。

1.3.2 樣品處理

在室溫下將20個(gè)軟木塞置于1 L廣口瓶內(nèi)，倒入乙醇溶液直至充滿廣口瓶，浸泡24 h后取出，作為樣品溶液。稱取1.5 g氯化鈉于20 mL頂空樣品瓶中，加入5 mL樣品溶液和0.1 mL的TCA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，壓蓋，備用。

1.3.3 頂空固相微萃取

平衡溫度40 ℃，平衡時(shí)間5 min，攪拌速度250 r/min；萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間30 min；解析溫度250 ℃，解析時(shí)間5 min。萃取頭老化溫度260 ℃，老化時(shí)間1 min。

1.3.5 氣質(zhì)聯(lián)用儀參數(shù)設(shè)置

進(jìn)樣口溫度：250 ℃。升溫程序：初始柱溫70 ℃，以10 ℃/min升溫至160 ℃，再以25 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 mL/min。載氣：純氦氣。色譜與質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時(shí)間7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的建立

前期已優(yōu)化了萃取條件及儀器參數(shù)，如1.2所示。方法檢出限以信噪比S/N=3表示，對TCA標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，直至信噪比為3，此時(shí)TCA濃度為0.51 ng/L，即為該方法的檢出限。本研究中低于檢出限的均認(rèn)為未檢出。

依照1.3.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。以TCA與TCA-D5的峰面積比為縱坐標(biāo)，TCA濃度為橫坐標(biāo)，所得線性關(guān)系方程為：y=0.0663x；線性決定系數(shù)R2：0.9999；線性濃度范圍：0.51～20.2 ng/L。

本研究對濃度為2.02 ng/L的標(biāo)液進(jìn)行了8次重復(fù)性試驗(yàn)，檢測結(jié)果見表1。采用測定樣品加標(biāo)回收率來評價(jià)方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果如表2所示。

綜上可以看出，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)為0.9999，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%，加標(biāo)回收率在98.1%～101.3%，檢出限為0.51 ng/L，說明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于檢測木塞中的TCA含量。

2.2 不同類別軟木塞中TCA遷移量分析

對2018年1月—2019年12月共計(jì)223批次軟木塞進(jìn)行了TCA檢測，不同類別軟木塞中TCA遷移量的整體情況如表3所示。檢出率最高的是1+1塞，達(dá)60%；其次是聚合塞；微顆粒塞和天然塞檢出率相對較低；而DIAM塞共檢測33批次，均未檢出TCA，這與DIAM塞的超臨界CO2萃取技術(shù)[12]密不可分，同時(shí)也說明木塞生產(chǎn)過程中TCA處理技術(shù)的重要性。

從TCA遷移量分布來看，不同類型的軟木塞差異較大，聚合塞中TCA遷移量范圍分布最寬，最高為5.76 ng/L，并且檢出的46批次中TCA遷移量的標(biāo)準(zhǔn)偏差也最大，說明聚合塞中TCA檢出值的離散程度最高；1+1塞雖檢出率最高，但TCA遷移量均在2.0 ng/L以下，檢出樣品的平均值為0.88 ng/L，遷移量范圍稍寬；天然塞和微顆粒塞檢出的TCA遷移量均在1.5 ng/L以下，范圍值較低。由此發(fā)現(xiàn)，聚合塞是造成葡萄酒TCA污染的最大風(fēng)險(xiǎn)源。

將TCA遷移量最高的聚合塞按照不同范圍值進(jìn)行劃分，如表4所示。TCA范圍在1～2 ng/L的超過半數(shù)，占比54.3%，說明大部分的TCA遷移量分布在1～2 ng/L范圍內(nèi)；2～4 ng/L的占比接近20%；4 ng/L以上的占比為8.7%，而且平均值在5.1 ng/L。

對于軟木塞TCA遷移量的限量標(biāo)準(zhǔn)國家尚未有明確規(guī)定，本文按照公司內(nèi)控軟木塞入廠檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對TCA的限定要求（即天然塞、微顆粒塞≤1 ng/L，聚合塞、1+1塞（聚合塞棒體）≤ 2ng/L），對不同類別軟木塞的合格率進(jìn)行匯總，如圖2所示。1+1塞和DIAM塞合格率均為100%，天然塞和微顆粒塞合格率均在90%以上，而聚合塞的合格率最低，為87.76%。所以葡萄酒在軟木塞選用中對聚合塞應(yīng)慎重選擇。

圖1 TCA標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 The standard curve of TCA

表1 重復(fù)性試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 1 Results of repeated test

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 2 Results of recovery test

3 討論與結(jié)論

本文通過對2年內(nèi)收集的多批次不同類別軟木塞中TCA遷移量的檢測，初步認(rèn)為DIAM塞為TCA“零污染”，主要原因是DIAM塞經(jīng)過了“超臨界二氧化碳萃取”這一特殊的技術(shù)處理，徹底去除了由軟木塞帶來的TCA污染[12]，現(xiàn)在越來越多被葡萄酒廠家選用，以確保葡萄酒固有的香氣，讓釀酒師有一種“放心感”。

聚合塞檢出率高，合格率低，而且TCA檢出值范圍最寬，認(rèn)為聚合塞對葡萄酒的污染風(fēng)險(xiǎn)程度最高。黨國芳等[18]對不同類型軟木塞裝瓶180 d和360 d后的樣品進(jìn)行品評，發(fā)現(xiàn)聚合塞封瓶的酒部分出現(xiàn)木塞味，在香氣方面表現(xiàn)明顯不如其它瓶塞（天然塞、1+1塞）封瓶的酒表現(xiàn)強(qiáng)烈；馮韶輝[19]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，浸泡聚合塞的酒液帶有比較濃的粉塵味道，類似米糠味，而浸泡天然塞和1＋1塞的酒液，除帶有輕微柔和的軟木味道外，沒有其他異味；李進(jìn)等[20]也在實(shí)驗(yàn)品評中得出了類似的結(jié)論。聚合塞通常采用天然塞的邊腳料和粘合劑制作而成[17,21]，生產(chǎn)過程中部分TCA并不能被去除，而且聚合塞密封性也較差，用此封裝的葡萄酒貨架期較短，一般用于快速消費(fèi)的低端餐酒。隨著葡萄酒市場的成熟，目前該類軟木塞使用數(shù)量也逐漸減少，部分被微顆粒塞所替代。相比聚合塞，微顆粒塞顆粒更小，TCA去除相對徹底，彈性和密封性均比聚合塞好。本研究也發(fā)現(xiàn)微顆粒塞的TCA檢出率較低，而且遷移量絕大部分（91.67%）在1.0 ng/L以下的可控范圍內(nèi)。

圖2 不同種類軟木塞TCA遷移量合格率Figure 2 Qualification rate of TCA migration in different types of cork

表3 不同類別軟木塞中TCA檢出率、遷移量范圍和平均值Table 3 The detection rate,migration range and average value of TCA in different types of cork

表4 聚合塞中TCA遷移量不同范圍占比和平均值Table 4 The proportion and average of TCA migration in different ranges in synthetic corks

本研究也發(fā)現(xiàn)，天然塞和1+1塞的TCA雖有檢出，但整體上檢出率和遷移量比較低，只要葡萄酒廠家選用可靠的供應(yīng)廠商，并進(jìn)行嚴(yán)格的入廠檢驗(yàn)，TCA污染風(fēng)險(xiǎn)可控。另外，建議葡萄酒廠家可根據(jù)需要選用更高技術(shù)含量的產(chǎn)品，如目前很多軟木塞廠家生產(chǎn)的“單只檢驗(yàn)”的天然塞，即通過人為感官或設(shè)備逐個(gè)塞子進(jìn)行TCA的檢測，保證每一只塞子的TCA遷移量均在1 ng/L以下，適用于高端葡萄酒產(chǎn)品。

雖然，軟木塞存在TCA污染的隱患，但仍然在葡萄酒使用中占據(jù)絕大部分的份額。據(jù)調(diào)查，天然軟木塞不僅是中國消費(fèi)者認(rèn)知度最高的瓶塞，并且是他們的首選，這就要求軟木塞生產(chǎn)廠家和葡萄酒生產(chǎn)廠家共同關(guān)注TCA污染的問題，保證消費(fèi)者買到放心的產(chǎn)品[22-23]。軟木塞的24 h浸泡試驗(yàn)?zāi)転槎唐谄績Φ钠咸丫铺峁┦躎CA污染的危險(xiǎn)指示，但是木塞本身有差異，而且封裝葡萄酒一段時(shí)間以后，TCA還可能從木塞基質(zhì)內(nèi)部向酒中進(jìn)一步遷移[24]，因此需要對封裝后葡萄酒中TCA遷移量進(jìn)一步跟蹤研究。