報春石斛種子萌發(fā)及原球莖的快繁培養(yǎng)條件研究

張梅 許冬月 朱自坤

摘 要：以報春石斛種子為實驗材料，研究了基本培養(yǎng)基、外源激素的種類和濃度及光照對報春石斛種子非共生萌發(fā)及分化的影響。結(jié)果表明：報春石斛種子在光照條件下1/2MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高，達92.44%，且萌發(fā)時間最短;在1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA培養(yǎng)基中，原球莖的分化效果最佳。

關(guān)鍵詞：報春石斛;非共生萌發(fā);激素;培養(yǎng)基

中圖分類號 S682文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）21-0027-03

Abstract：The aim was to study the culture conditions of seed germination and protocorm rapid propagation in Dendrobium primulinum.Using the seeds of D. primulinum as materials，the effects of the basic culture mediums，the type and concentration of exogenous hormones and the light on the non-symbiotic germination and subsequent differentiation were studied. Under the conditons of 1/2MS medium and light，the Dendrobium seeds had the highest germination rate of 92.44%，and the germination time was shortest. The protocorm differentiation effect was best in the 1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA medium.The study laid a foundation for the realization of the future industrial production of D. primulinum.

Key words：Dendrobium primulinum;Non-symbiotic germination;Hormone;Medium

報春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物。春季開花，姿態(tài)優(yōu)美，花色艷麗多彩，花期長，耐溫性強，作為盆花深受消費者的喜愛，具有極高的觀賞價值[1]。石斛為合軸生長，分株是其繁殖的主要方式，但也存在周期長、繁殖率低、對生長條件的要求較為苛刻等缺點，不能滿足國內(nèi)外市場的需求[2]，加之人為的掠奪性采挖，導致其野生資源日益減少。

蘭科植物種子雖多，但由于其不具有發(fā)育完全的胚，萌發(fā)率極低[3]，在自然條件下需要與真菌共生才可以萌發(fā)。當前，報春石斛的組織培養(yǎng)研究主要集中在莖段和莖尖再生體系[4-6]與種子非共生萌發(fā)[7-8]方面。本研究從不同的培養(yǎng)基、不同激素的配比、光照3個組培基本條件，對報春石斛蘭的非共生萌發(fā)及原球莖分化條件進行了研究，以期為實現(xiàn)利用種子萌發(fā)技術(shù)擴大報春石斛繁殖提供理倫依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用云南屏邊大圍山野生報春石斛成熟的未開裂蒴果內(nèi)種子。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將報春石斛蘭蒴果用流水沖洗干凈，在超凈工作臺中用90%酒精仔細擦拭果莢表面，再用75%酒精中浸透，置于酒精燈上灼燒，重復3次。

1.2.2 培養(yǎng)基萌發(fā)誘導培養(yǎng) 在超凈工作臺上，用無菌的解剖刀將消毒后的蒴果縱向剖成兩半，用無菌鑷子將種子挑出放入無菌水中混合，用消毒后的針筒吸取少量的種子，均勻的撒在KC、改良KC、1/2MS、1/4MS、MS、N6等6種培養(yǎng)基表面。每種培養(yǎng)基接種20瓶，并用放大鏡統(tǒng)計各瓶接種種子數(shù)，分成2批，一批的培養(yǎng)條件為光照12h/d，光照強度為1500lx，溫度為（25±2）℃;另一批為暗培養(yǎng)。每天觀察種子萌發(fā)情況，記錄最早萌發(fā)時間及培養(yǎng)30d的生長狀態(tài)，萌發(fā)的標準為出現(xiàn)白色原球莖。

1.2.3 外源激素萌發(fā)誘導培養(yǎng) 種子萌發(fā)生長形成原球莖后，將原球莖轉(zhuǎn)接在添加不同濃度6-BA、NAA的培養(yǎng)基中，觀察原球莖在不同激素濃度下的分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響 從表1可以看出：在未添加任何植物激素的情況下，光照培養(yǎng)10d時，在1/2MS培養(yǎng)中的萌發(fā)率最高達92.44%，并且萌發(fā)所需時間最短;而在KC培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最低，僅為35.42%。光照培養(yǎng)與暗培養(yǎng)對報春石斛蘭種子萌發(fā)的影響是有差異的，暗培養(yǎng)條件下的萌發(fā)率降低。不同培養(yǎng)基萌發(fā)率的從高到低依次為1/2MS>1/4MS>MS>N6>改良KC>KC。接種30d后，原球莖的生長表現(xiàn)差異明顯，KC和改良KC培養(yǎng)基中萌發(fā)率最低，萌發(fā)后的種子未形成原球莖，慢慢死亡。其他培養(yǎng)基中的原球莖均有所生長，在N6和MS培養(yǎng)基中的部分原球莖膨大分化，有小部分種子萌發(fā)后就沒有形成原球莖。在1/2MS與1/4MS培養(yǎng)基中的原球莖大部分已分化，但1/4MS培養(yǎng)中形成的原球莖在后期出現(xiàn)顏色偏黃。

2.2 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對種子萌發(fā)的影響 在光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)條件下，種子均能萌發(fā)，但在同一個培養(yǎng)基上，光照條件下的萌發(fā)率明顯高于暗培養(yǎng)條件下的，并且原球莖的生長狀態(tài)較好。在光照培養(yǎng)條件下，1/2MS培養(yǎng)基中的種子萌發(fā)率最高，萌發(fā)時間短;而在黑暗條件下培養(yǎng)時培養(yǎng)到第20天時種子才萌發(fā)，萌發(fā)率由92.44%降低至56.36%，并且原球莖細小瘦弱。試驗結(jié)果表明，光照條件下種子萌發(fā)時間比暗培養(yǎng)條件下所需的時間短，萌發(fā)率提高。接種30d后，在同一個培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)下的原球莖生長狀態(tài)比光照培養(yǎng)下的差，并且原球莖小，生長緩慢，顏色偏黃。

2.3 激素對原球莖分化的影響 種子在培養(yǎng)基中形成原球莖時，將其接種與不同濃度的NAA和6-BA的1/2MS培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示，原球莖的分化并不是隨著6-BA濃度的增加，效果就越來越好（表2）。在培養(yǎng)基中添加0.2mg/LNAA和0.5mg/L6-BA時原球莖分化較快，長勢最好，培養(yǎng)30d時，原球莖已分化出小苗，部分小苗長出根，小苗頂端有3～4片小葉。不添加任何激素的情況下，原球莖也能分化出小苗，但所需時間長。培養(yǎng)基中細胞分裂素濃度大于生長素濃度時，較有利于原球莖的分化。8號培養(yǎng)基（0.2mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）和12號培養(yǎng)基（0.2mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）的原球莖分化速度快，但分化形成苗較小。不同植物對激素濃度的比例要求有所不同，當細胞分裂素濃度過高時，會影響原球莖的分化。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基 蘭花種子的胚發(fā)育不完全，自然環(huán)境下萌發(fā)困難，通常需要與真菌共生才能萌發(fā)，利用不同的培養(yǎng)基進行非共生萌發(fā)，能夠快速促進種子萌發(fā)。在本試驗中，用KC、改良KC、1/2MS、1/4MS、MS、N6培養(yǎng)基對報春石斛蘭種子進行培養(yǎng)，結(jié)果表明，種子在1/2MS與1/4MS培養(yǎng)中萌發(fā)率最高，分別為92.44%、90.27%，且萌發(fā)需要時間短。不同的培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響，可能是由于培養(yǎng)基中所含的元素不同導致。本次研究結(jié)果與毛秀華[9]、余樂[8]等進行的石斛種子萌發(fā)試驗結(jié)果相似，降低無機鹽濃度有利于種子的生長和萌發(fā)，而與周華偉報道的石斛種子萌發(fā)需要無機鹽濃度很高的培養(yǎng)基是不一樣的[10]。

3.2 光照 植物種子的萌發(fā)除受種子內(nèi)部生理特性和培養(yǎng)基等條件的影響外，還受到了外部環(huán)境因素的影響。不同的蘭花種子萌發(fā)對光照要求不同，有些蘭花則光照培養(yǎng)反而會抑制其萌發(fā)，進行暗培養(yǎng)后會提高萌發(fā)率，比如加入活性炭為種子萌發(fā)創(chuàng)造黑暗，也是黑暗培養(yǎng)的一個手段。本試驗中，通過對報春石斛種子在光照和黑暗條件下相同培養(yǎng)基中進行萌發(fā)比較發(fā)現(xiàn)，種子在光照和黑暗條件下均能萌發(fā)，只是在光照條件下的萌發(fā)率高，生長速度快，原球莖分化正常。在本試驗中也發(fā)現(xiàn)新的試驗現(xiàn)象，在同一批次的種子中，報春石斛蘭果莢中會有小部分的未發(fā)育成熟的種子，在光照培養(yǎng)過程中并未萌發(fā)，但種子并未死亡。經(jīng)過暗培養(yǎng)后，在后期種子開始萌發(fā)。

3.3 不同激素的配比 種子萌發(fā)形成原球莖時，對激素的需求會變得越來越敏感，分化程度會越來越明顯。研究結(jié)果顯示，添加適宜的激素可以促進原球莖的分化，當在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/L6-BA時，原球莖分化最快，此時2種激素的比例達到最佳，這與余樂等研究結(jié)果相似[8]。而細胞分裂素過高則會影響原球莖的分化和生長，高濃度細胞分裂素下的原球莖發(fā)黃，分化出的小苗是黃綠色的。

研究發(fā)現(xiàn)，影響報春石斛種子萌發(fā)的因素除了上述幾個方面以外，還有糖濃度、酸堿度（pH）、維生素、天然復合物（椰乳、香蕉泥、蘋果汁、馬鈴薯、蛋白胨等）、遺傳因素及光照等[11]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，蘭花種子的萌發(fā)與種皮致密，透氣性差或種皮含有抑制物有關(guān)[12]。阻礙蘭科植物種子萌發(fā)的機制較復雜，還有待進一步研究。因此，今后有必要從多維的角度去認識和研究這一試驗現(xiàn)象。

報春石斛蘭種子數(shù)量多，快速繁殖可利用這一優(yōu)勢，利用種子進行非共生萌發(fā)，進行不斷的分化和增殖，產(chǎn)生種苗，這一途徑是蘭花種苗工廠化生產(chǎn)的重要途徑。本文探討了報春石斛種子非共生萌發(fā)及形成原球莖分化的最適條件，為工廠化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)，對其快速繁殖具有一定的參考意義。

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