舒肝解郁飲對抑郁大鼠行為學及作用機制研究①

李 寧 周珊珊 胡 蕊 高媛媛 王潮敏 王育梅

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科,石家莊 050000)

抑郁癥為各種原因引起的一組心境障礙和情感障礙，主要癥狀為抑郁，是以抑郁心境自我體驗為中心的臨床癥狀群[1]。CRP、FGF、TNF-α水平變化與抑郁癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關，長期應激可引起CRP和TNF-α表達升高、使FGF表達降低，從而引起腦額葉神經(jīng)元神經(jīng)元再生障礙，從而引起抑郁的發(fā)生:如Roomruangwong C1發(fā)現(xiàn)妊娠和分娩可引起CRP水平升高，高CRP水平可預測產(chǎn)后抑郁癥[2]；Liu等[3]研究發(fā)現(xiàn)將小鼠暴露于慢性輕度壓力4周可引起小鼠血漿TNF-α等促炎因子水平升高，促炎因子水平的升高通過上調吲哚胺2,3-雙加氧酶及皮質神經(jīng)元損傷介導慢性輕度壓力誘導的抑郁癥。舒肝解郁飲具有健胃消食、清熱除煩、舒肝解郁、養(yǎng)心安神等功效，治療抑郁癥效果顯著[4]。目前的研究對舒肝解郁飲治療抑郁時額葉CRP、FGF、TNF-α水平變化尚不清楚，對此，本文建立大鼠抑郁模型，給予舒肝解郁飲治療，觀察其對大鼠行為學及額葉CRP、FGF、TNF-α水平的影響，探討舒肝解郁飲治療抑郁癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級、雄性Wistar大鼠60只，體重190～210 g，購自北京生命科學研究所，許可證號SYXK(京)2015-0003。

1.1.2舒肝解郁飲 主要成分為柴胡15 g、郁金15 g、香附15 g、當歸15 g、木香10 g、半夏10 g、陳皮15 g、三仙45 g、白芍15 g、酸棗仁20 g、川穹10 g、丹皮20 g、丹參20 g、瓜萎20 g等，將上述中藥成分加水剪成每100 ml溶液含生藥量350 g的煎劑。

1.1.3主要試劑 腦組織CRP、FGF、TNF-α試劑盒(美國Sigma公司)，小鼠抗大鼠CRP單克隆抗體(貨號:bsm-0391M)、小鼠抗大鼠FGF單克隆抗體(貨號:ab8880)、小鼠抗大鼠TNF-α單克隆抗體(貨號:CL-0387T)、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)等。

1.2方法

1.2.1大鼠分組和抑郁大鼠模型建立 將60只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、舒肝解郁飲低劑量組、舒肝解郁飲高劑量組，每組15只。模型組、舒肝解郁飲低劑量組、舒肝解郁飲高劑量組大鼠采用慢性不可預見性應激建立抑郁大鼠模型，采用7種應激方式，分別為禁水24 h、禁食24 h、夾尾(止血鉗在距離大鼠尾根部1 cm處夾尾持續(xù)1 min)、足底電擊(電壓36 V、電流1 mA，電擊1次/10 s，持續(xù)10 s，共電擊10次)、4℃冰水中游泳(5 min)、大鼠籠傾斜45°(7 h)、晝夜顛倒(24 h)。7種應激方式每天1種，每周循環(huán)1次，每周采用不同的時間點和不同順序，共21周。對照組大鼠不給予任何應激。造模過程中，模型組大鼠死亡2只，舒肝解郁飲低劑量組和舒肝解郁飲高劑量組大鼠各死亡1只，對照組大鼠沒有死亡。

1.2.2各組大鼠給藥 在造模3周結束時進行敞箱實驗判斷造模是否成功，第22天開始舒肝解郁飲低劑量組和舒肝解郁飲高劑量組大鼠分別給予劑量為30 g/kg和60 g/kg的舒肝解郁飲煎劑灌胃，共3周。對照組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水。

1.2.3大鼠抑郁行為學評價 采用敞箱實驗評價大鼠抑郁行為:制作一個40 cm×80 cm×80 cm的敞箱，敞箱的底面和內(nèi)壁漆成黑色，將敞箱底面分成25個面積相等的方格，把大鼠放在敞箱中央，水平運動得分為穿越底面方格數(shù)，穿越1格得1分；垂直得分為雙足離地的直立次數(shù)，雙足離地1次得1分，共測定5 min。

1.2.4標本采集 各組大鼠敞箱實驗結束后斷頭，快速在冰上取腦組織，分離大鼠額葉組織用于測定腦組織CRP、FGF、TNF-α水平。

1.2.5額葉CRP、FGF、TNF-α水平測定 將各組大鼠額葉腦組織加入生理鹽水搗碎，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法測定額葉CRP、FGF、TNF-α水平(具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行)。

1.2.6額葉CRP、FGF、TNF-α蛋白水平測定 采用Western blot法測定額葉CRP、FGF、TNF-α蛋白水平:每只小鼠取300 mg腦組織加入裂解液勻漿后提取各組大鼠額葉腦組織總蛋白質，采用分光光度檢測儀測量蛋白濃度，在95℃水浴中配置上樣液，將腦組織蛋白樣品和上樣液以1∶1比例混勻，進行電泳(每孔蛋白上樣量為30 μg)、轉膜、封閉，封閉后置入一抗(以小鼠抗大鼠CRP單克隆抗體、小鼠抗大鼠FGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠TNF-α單克隆抗體為一抗，抗體稀釋比例1∶500)中過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，放入二抗(稀釋比例1∶2 000)中孵育2 h，加入顯影液顯影。

2 結果

2.1各組大鼠敞箱測試分值比較 與對照組比較，模型組敞箱實驗水平運動得分和垂直運動得分均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，舒肝解郁飲低劑量組、舒肝解郁飲高劑量組敞箱實驗水平運動得分和垂直運動得分均明顯升高(P<0.05)；與舒肝解郁飲低劑量組比較，舒肝解郁飲高劑量組敞箱實驗水平運動得分和垂直運動得分均升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠額葉CRP、TNF-α水平比較 與對照組比較，模型組額葉CRP、TNF-α水平均升高(P<0.05)，F(xiàn)GF水平降低(P<0.05)；與模型組比較，舒肝解郁飲低劑量組、 舒肝解郁飲高劑量組額葉CRP、FGF、TNF-α水平均降低(P<0.05)，F(xiàn)GF水平升高(P<0.05)；與舒肝解郁飲低劑量組比較，舒肝解郁飲高劑量組額葉CRP、TNF-α水平均降低(P<0.05)，F(xiàn)GF水平升高(P<0.05)。見表2。

GroupsnHorizontalsports scoreVerticalmotion scoreControl group1595.74±16.3732.36±9.42Model group1334.25±10.481)12.17±3.851)Shugan Jieyu Yin low dose group1447.26±12.311)2)18.83±4.261)2)Shugan Jieyu Yin high dose group1458.38±13.641)2)3)23.24±5.171)2)3)F55.14226.199P<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu Yin low dose group,3)P<0.05.

圖1 各組大鼠額葉CRP、FGF、TNF-α蛋白Western blot電泳圖Fig.1 Western blot analysis of CRP,FGF and TNF-α protein in frontal lobe of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shugan Jieyu Yin low dose group;4.Shugan Jieyu Yin high dose group.

GroupsnCRP(ng/L)FGF(ng/L)TNF-α(ng/L)Control group151 148.53±142.35126.43±11.62667.48±23.14Model group132 174.28±186.471)67.51±8.741)812.68±26.531)Shugan Jieyu Yin low dose group141 654.32±164.361)2) 81.02±9.321)2)754.25±23.161)2)Shugan Jieyu Yin high dose group141 375.46±152.131)2)3) 92.51±9.851)2)3)720.51±24.021)2)3)F103.01390.78588.264P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu Yin low dose group,3)P<0.05.

GroupsnRelative expressionof CRP proteinRelative expressionof FGF proteinRelative expressionof TNF-α proteinControl group151.00±0.011.00±0.021.00±0.01Model group134.32±0.731)0.41±0.041)2.69±0.121)Shugan Jieyu Yin low dose group143.24±0.581)2)0.57±0.061)2)1.96±0.091)2)Shugan Jieyu Yin high dose group142.15±0.511)2)3)0.80±0.071)2)3)1.53±0.081)2)3)F104.620361.0391 013.477P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu yin low dose group,3)P<0.05.

2.3各組大鼠額葉CRP、FGF、TNF-α蛋白水平比較 與對照組比較，模型組額葉CRP、TNF-α蛋白水平均升高(P<0.05)，F(xiàn)GF蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，舒肝解郁飲低劑量組、舒肝解郁飲高劑量組額葉CRP、TNF-α蛋白水平均降低(P<0.05)，F(xiàn)GF蛋白水平升高(P<0.05)；與舒肝解郁飲低劑量組比較，舒肝解郁飲高劑量組額葉CRP、TNF-α蛋白水平均降低(P<0.05)，F(xiàn)GF蛋白水平升高(P<0.05)。見表3，圖1。

3 討論

抑郁癥發(fā)病率高，是情感性障礙的一種類型，主要特征為顯著而持久的情緒低落，主要表現(xiàn)為精神運動性抑制、思維遲緩、情緒低落，部分抑郁癥患者出現(xiàn)自殺觀念和行為，抑郁癥為精神科自殺率最高的疾病，給患者和家屬帶來巨大痛苦，對社會造成巨大損失[5]。抑郁癥發(fā)生的主要原因為神經(jīng)中樞5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質水平降低及其受體功能降低。另有研究表明，抑郁癥發(fā)生和炎癥細胞因子水平關系密切，炎癥細胞因子水平越高則抑郁癥的程度越嚴重[6]。CRP在組織損傷和感染時濃度迅速升高，是組織損傷時機體急性反應產(chǎn)物，抑郁癥的發(fā)病伴隨免疫炎癥反應的激活，炎癥細胞因子分泌增加、出現(xiàn)明顯的炎癥級聯(lián)反應[7]，抑郁癥患者血清CRP水平升高，如何曉燕等[8]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清hs-CRP水平升高。TNF-α參與機體的體液和細胞免疫，影響中樞神經(jīng)遞質釋放，具有免疫調節(jié)、殺傷腫瘤細胞、參與炎癥反應的作用，在免疫反應和炎癥反應的啟動和維護中發(fā)揮重要作用，在生理條件下TNF-α不通過血腦屏障，病理情況下外周TNF-α進入腦內(nèi)，與腦內(nèi)的細胞因子一起影響神經(jīng)的生化和行為等，發(fā)揮炎癥細胞因子的中樞效應，抑郁癥伴有免疫炎癥反應的激活[9]，抑郁癥患者TNF-α水平升高，如伏簫燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠腦內(nèi)TNF-α被激活。FGF是神經(jīng)元成活和生長、新皮質發(fā)育、干細胞增殖的重要因素，可誘導前體細胞向多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺神經(jīng)元分化，與神經(jīng)的可塑性關系密切，在大腦的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[11,12]，抑郁癥患者FGF水平下降，如徐宇浩等[13]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清FGF-22水平下降。額葉在調節(jié)抑郁癥患者認知和情緒中發(fā)揮重要作用，參與抑郁癥患者的病理生理過程，研究發(fā)現(xiàn)抑郁行為小鼠額葉TNF-α等炎癥細胞因子水平升高[14]，慢性應激抑郁大鼠額葉皮層FGF-2水平下降[15]。本研究對慢性不可預見性應激抑郁大鼠額葉CRP、FGF、TNF-α水平進行研究，結果發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠額葉CRP、TNF-α水平升高，F(xiàn)GF水平降低，與上述研究報道結果一致。

中醫(yī)認為，肝的疏泄功能受人的情志影響，情志異?？梢鸶螝庥艚Y，肝氣郁結可引起血瘀、影響脾的運化，脾失健運可引起食郁、痰郁、濕郁，諸郁日久化熱，病情遷延，病邪耗氣傷血劫陰，產(chǎn)生肝腎陰虛、心脾氣血兩虛，從而引起抑郁癥的發(fā)生[16]。中藥在抑郁癥的治療中有一定療效，可通過影響腦內(nèi)炎癥因子發(fā)揮改善抑郁癥狀的作用，如沈軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)當歸提取物可通過調控大鼠額葉炎癥細胞因子水平改善慢性不可預知性應激大鼠的抑郁癥狀；杜青等[18]研究發(fā)現(xiàn)百合疏肝安神湯可能通過對大鼠額葉、海馬等組織中炎癥細胞因子水平的影響發(fā)揮抗抑郁的作用。舒肝解郁飲組方中，柴胡為君藥，具有行氣疏肝解郁的功效；木香具有行氣止痛功效；香附具有理氣疏肝功效；郁金辛寒行散、入血而行氣；川穹祛風止痛、活血行氣；當歸養(yǎng)血和血等，主要合用具有清熱除煩、健胃消食、養(yǎng)心安神、舒肝解郁的功效，在抑郁癥的治療中具有良好效果[19]。本文對舒肝解郁飲對抑郁大鼠額葉CRP、FGF、TNF-α水平的影響進行研究，探討其治療抑郁癥的可能機制，結果發(fā)現(xiàn)疏肝解郁飲可改善大鼠的抑郁行為，降低額葉CRP、TNF-α水平，升高FGF水平。表明舒肝解郁飲對抑郁癥大鼠的抑郁癥狀具有改善作用，其機制可能通過促進神經(jīng)元增殖與修復，降低抑郁癥大鼠額葉炎癥細胞因子活性，抑制免疫炎癥反應，從而調節(jié)機體免疫系統(tǒng)，發(fā)揮對大鼠抑郁行為的影響。