楊樹miR393對FBL基因家族成員調(diào)控作用的鑒定

唐 芳，楚立威，賀學(xué)嬌，舒文波，盧孟柱

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 a.林業(yè)研究所；b.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) a.教育部園藝植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.園藝與林業(yè)科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

microRNAs（miRNAs）是一類長度為21 ～ 22 個(gè)核苷酸的負(fù)調(diào)控非編碼小RNA，可以對其特異的靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控[1-2]。大部分miRNAs 是以獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位存在，由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄成的原始轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），可以形成一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)并被進(jìn)一步剪切，釋放出成熟的miRNAs。植物miRNAs 通過靶向mRNA 進(jìn)行剪切或翻譯抑制，在植物發(fā)育和環(huán)境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。miRNA 是通過堿基互補(bǔ)配對原則選擇靶基因的，因此一個(gè)靶基因家族中的成員因具有同源度高的結(jié)構(gòu)域，可能會(huì)同時(shí)受到相同miRNA 的調(diào)控。

大多數(shù)miRNA 家族在植物進(jìn)化過程中具有較高的保守性[5]。miR393 作為植物體中保守的miRNA 家族之一，在擬南芥、水稻、楊樹等不同植物物種中均存在。盡管編碼miR393 前體的序列在物種內(nèi)、物種間各有不同，但其成熟體序列相同或只有1 ～2 個(gè)堿基的差別[6-8]。擬南芥miR393是由MIR393a 與MIR393b 2 個(gè)前體編碼而來，但成熟體序列完全相同，它的靶基因是4 個(gè)F-box 家族的生長素受體基因（TIR/AFB）[6]，miR393 可直接對TIR/AFB轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行剪切，起負(fù)調(diào)控作用[5-6,9]。 在水稻中，miR393 2 個(gè)前體編碼的成熟體只有1 個(gè)堿基長度的差異，且只靶向剪切OsTIR1與OsAFB22 個(gè)基因[10-11]。在楊樹中，通過小RNA與降解組高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR393 由4 個(gè)前體編碼，但成熟體序列完全相同，并且有4 個(gè)TIR/AFB同源家族基因可能受到miR393 的剪切[12]。

在不同植物中，受miR393 調(diào)控的靶基因都屬于TIR1的同源基因。美國Estelle 實(shí)驗(yàn)室[13]和英國Leyser 實(shí)驗(yàn)室[14]均于2005年同時(shí)證實(shí)TIR1 是一種生長素受體蛋白，在擬南芥中其屬于7 個(gè)相關(guān)F-box 蛋白基因中一個(gè)小的亞家族[15]。該蛋白是在擬南芥對抗生長素運(yùn)輸抑制劑遺傳研究時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，故名為“運(yùn)輸抑制應(yīng)答因子1”（Transport Inhibitor Response Protein 1，TIR1）。有研究證明，擬南芥中存在6 個(gè)TIR1基因的同源基因，分別是AFB1、AFB2、AFB3、AFB4、AFB5和COL1，它們作為一個(gè)基因家族在擬南芥中起著包括生根、幼苗生長發(fā)育、種皮發(fā)育在內(nèi)各不相同的作用[16-18]。 在楊樹中也有與擬南芥TIR1家族直系同源的基因家族，即FBL基因家族[19]。該基因家族有8 個(gè)成員，其中FBL1對楊樹根的發(fā)育起到十分重要的作 用[20]，而對于其他家族成員的功能研究還尚未有報(bào)道。擬南芥的4 個(gè)F-box 家族成員TIR1、AFB1、AFB2、AFB3受到miR393 的剪切調(diào)控[6]，而楊樹有8 個(gè)同源的FBL基因，它們是否也受到miR393 的調(diào)控需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

為揭示楊樹miR393 對FBL基因家族不同成員的調(diào)控作用，本研究首先從系統(tǒng)進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)等方面對楊樹FBL家族成員進(jìn)行分析，再通過miR393 與FBL基因家族成員的序列比對、miR393及FBL家族基因在楊樹不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的表達(dá)模式和5′-RACE 檢測，驗(yàn)證出FBL基因家族8 個(gè)成員中只有PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4是miR393 的靶基因。通過揭示miR393對FBL基因家族不同成員調(diào)控的差異，為進(jìn)一步研究mi393-FBL 調(diào)控關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 FBL 基因家族的鑒定及物種間的關(guān)系

從植物基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov，V12.1）中下載擬南芥、水稻、楊樹和小立碗蘚FBL家族成員的核酸及氨基酸序列。利用ClustalX2 對其核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對[21]，并使用MEGA5.0 中的鄰近算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]，來分析擬南芥、水稻、楊樹及小立碗蘚FBL基因家族的進(jìn)化關(guān)系。

1.2 楊樹FBL 基因結(jié)構(gòu)與motif 分析

利用Gene struture display server（GSDS，http://gsds.cbi.pku.edu.cn）對楊樹FBL基因家族8個(gè)成員的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及miR393 剪切位點(diǎn)進(jìn)行分析[23]。利用NCBI 上的Conserved Domain Database 軟件（CDD，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對楊樹FBL家族8 個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，通過IBS1.0[24]軟件對預(yù)測結(jié)果與miR393 剪切位點(diǎn)進(jìn)行繪圖。

1.3 楊樹不同時(shí)期及不同組織RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

為了研究楊樹miR393 和FBL家族不同基因在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織的表達(dá)模式，分別選擇84K 楊（Populus alba×Populus glandulosa）半個(gè)月組培苗的葉（L-0.5M）、莖（S-0.5M）和根（R-0.5M），1 個(gè)月組培苗的葉（L-1M）、莖（S-1M）和根（R-1M），3 個(gè)月土培苗的頂端分生組織（SAM-3M）、未展開葉（YL-3M）、第1 至3 片展開葉（ML-3M）、第1 個(gè)莖段（N1-3M）、第5 莖段（N5-3M）、第10 莖段（N10-3M）、莖基部（Base-3M）和根（R-3M）為材料，采用LC sciences 總RNA 純化試劑盒（#TRK-1001，LC sciences）提取上述植物材料的總RNA（包含mRNA、rRNA、miRNA 和其他小RNA）。取1.5 μg 起始量的總RNA，首先通過Poly(A) Tailing Kit（#AM1350，ThermoFisher）將3′ 端 無PolyA的RNA 加上PolyA 尾，再取10 μL 加PolyA 尾的RNA（750 ng），使用SuperScript? III 第一鏈合成系統(tǒng)（#18080-051，ThermoFisher）進(jìn)行反轉(zhuǎn)第一鏈cDNA 的合成，反轉(zhuǎn)錄過程按說明書進(jìn)行，通用反轉(zhuǎn)錄引物為5′-AACGAGACGACGACAGA CTTTTTTTTTTTTTTTV-3′。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋20 倍后進(jìn)行后續(xù)的定量qRT-PCR。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使 用Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm）對ptc-miR393 和FBL家族基因進(jìn)行定量PCR 的引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)原則為20 ～25 bp 長度，退火溫度58 ～60 ℃，PCR 產(chǎn)物長度為150 ～250 bp，引物序列見表1，其中PP2A-2為內(nèi)參基因。定量PCR 反應(yīng)體系為：10 μL KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（#K4601，KAPA）、2 μL 上述稀釋20 倍的cDNA、定量上下游引物（10 μmol ）各0.8 μL 和6.4 μL 去離子水，每個(gè)樣本進(jìn)行4 個(gè)技術(shù)重復(fù)。在LightCycler 480定量PCR 儀（Roche）上進(jìn)行定量PCR 的運(yùn)行，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s， 72 ℃ 3 s，重復(fù)45 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 3 s。融解曲線分析條件：95 ℃ 5 s（以每s 增加0.11 ℃的速率使65 ℃增至95 ℃）。

表1 楊樹FBL 基因家族定量PCR 引物序列Table 1 Quantitative PCR primer sequences of poplar FBLgene family

1.5 miR393對楊樹FBL家族基因剪切的5′-RACE驗(yàn)證

為了檢測ptc-miR393 對楊樹FBL家族基因的剪切情況，需要通過5′-rapid amplification of cDNA ends（5′-RACE）實(shí)驗(yàn)對楊樹8 個(gè)FBL基因分別進(jìn)行剪切位點(diǎn)的驗(yàn)證。首先，在ptc-miR393 對FBL1-8基因可能的剪切位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)2 條基因特異的巢式引物（表2），之后分別與上游SMART II A 接頭上的通用outer 引物（5′-ctaatacgactcactat agggcAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′） 和inner引物（5′-ctaatacgactcactatagggc-3′）進(jìn)行兩輪巢式PCR 的擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)以84K 楊組培苗為材料，采用LC sciences 總RNA 純化試劑盒（#TRK-1001，LC sciences）提取組培苗全株的總RNA，再通過SMART ? RACE cDNA Amplification Kit（Clontech，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄出帶SMART II A 接頭的第一鏈cDNA。將cDNA 稀釋10 倍后，利用Takara EX Taq（#RR902A，TaKaRa） 進(jìn)行巢式PCR 的第一輪反應(yīng)，取1 μL 第一輪產(chǎn)物作為模板進(jìn)行巢式PCR 的第二輪反應(yīng)。第二輪PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳后，切取目標(biāo)片段，經(jīng)回收純化后連接到PMD19-T 克隆載體（#6013，TaKaRa），轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)大腸桿菌，涂板后37 ℃過夜培養(yǎng)，每個(gè)菌板挑15 個(gè)單克隆進(jìn)行測序。

表2 楊樹FBL 基因家族5′-RACE 特異引物序列Table 2 5′-RACE specific primer sequences of poplar FBLgene family

2 結(jié)果與分析

2.1 FBL 基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

為分析楊樹FBL家族基因與其他物種同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究分別選取雙子葉植物、單子葉植物和蕨類植物代表物種擬南芥、水稻和小立碗蘚3 個(gè)物種的FBL家族基因成員與楊樹進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。如圖1 所示，F(xiàn)BL基因家族在擬南芥、楊樹、水稻和小立碗蘚中分別有7個(gè)、8 個(gè)、8 個(gè)和12 個(gè)成員。4 個(gè)物種的FBL基因按照蛋白序列主要分為了兩個(gè)大的亞群，楊樹的8 個(gè)FBL基因主要聚在了第一大亞群，這個(gè)大亞群又分為4 個(gè)小亞群。PtFBL3和PtFBL4與擬南芥的ATFBL2和ATFBL3先聚在一起，再和水稻的LOC_Os04g32460 聚在一起，最后和LOC_Os11g31620 聚成一個(gè)小亞群。PtFBL1和PtFBL2和AtTIR1先聚類到一起，再與ATFBL1聚類，最后與水稻的LOC_Os05g05800 構(gòu)成第二個(gè)小亞群；PtFBL5 和PtFBL6 與小立碗蘚的Pp3c20_17150 和Pp3c23_5870 以 及Pp3c23_11300 和Pp3c24_9800聚類組成第三個(gè)小亞群。第四個(gè)小亞群是由楊樹的PtFBL7和PtFBL8與擬南芥的ATFBL4和ATFBL5兩兩聚類，再一起與水稻的LOC_Os02g52230 和LOC_Os03g08850 聚類。在第二個(gè)大亞群中沒有楊樹的基因，也可以分為4 個(gè)亞群：LOC_Os01g63420、LOC_Os05g37690、LOC_Os03g15880 和ATCOL1 聚成一個(gè)小亞群；小立碗蘚的Pp3c20_4050、Pp3c23_18960、Pp3c3_8580；Pp3c9_10120、Pp3c15_1200 和Pp3c17_7680， 以及Pp3c18_16630 和Pp3c22_6020 分別單獨(dú)聚類在一起。從進(jìn)化樹也可以看出，楊樹PtFBL1-PtFBL4具有較高的同源性，它們是在一個(gè)進(jìn)化分支上，而PtFBL5、PtFBL6和PtFBL7、PtFBL8分別位于不同的分支且與PtFBL1—PtFBL4的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。另外，小立碗蘚的FBL同源基因具有相對獨(dú)立的進(jìn)化分支。

圖1 楊樹、擬南芥、水稻和小立碗蘚FBL 基因家族的 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic trees of the FBL gene family in Poplar, Arabidopsis, rice and Physcomitrella

2.2 楊樹FBL 基因家族的功能結(jié)構(gòu)分析

利用Gene structure display server（GSDS）對楊樹FBL基因家族8 個(gè)成員的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并在結(jié)果中搜索潛在的ptc-miR393剪切位點(diǎn)。如圖2 所示，除了PtFBL7包含4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子之外，其余7 個(gè)FBL基因均由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。其中，PtFBL5與PtFBL6與其他FBL基因相比，具有較長的內(nèi)含子和3′UTR 區(qū)序列。此外，ptc-miR393 在PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3與PtFBL4中都具有相似度高的互補(bǔ)配對序列且均位于第3 個(gè)外顯子上。

利用Conserved domain database（CDD）軟件對楊樹FBL家族8 個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3、PtFBL4、PtFBL5和PtFBL6都具有關(guān)鍵的F-box 結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)ANN1 super family 結(jié) 構(gòu) 域， 而PtFBL7和PtFBL8則缺少了F-box 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)ANN1 super family 結(jié)構(gòu)域（圖3）。此外，PtFBL3、PtFBL7和PtFBL8在第二ANN1 super family 結(jié)構(gòu)域下游都多了一個(gè)LRR_RI super family 結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與ANN1 super family 結(jié)構(gòu)域有重疊的部分，而ptc-miR393 的互補(bǔ)配對序列位 于 基 因 的F-box、ANN superfamily1、ANN superfamily2 結(jié)構(gòu)域之后。

圖2 楊樹FBL 家族基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig.2 Exon/Intron structure of poplar FBLfamily genes

圖3 楊樹FBL 基因家族成員的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of poplar FBL gene family members

2.3 楊樹FBL 基因家族受miR393 剪切的調(diào)控作用

為了檢測ptc-miR393 對楊樹FBL家族成員的靶向作用，利用ClustalX2 對楊樹FBL基因家族8 個(gè)成員的CDS 序列和ptc-miR393 進(jìn)行了序列相似性分析，結(jié)果顯示，PtFBL1和PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4、PtFBL5和PtFBL6及PtFBL7和PtFBL8兩兩之間的序列相似度分別為91.51%、93.94%、92.55%和90.20%，而這8 個(gè)基因之間的序列相似度僅有57.48%，說明楊樹FBL基因之間存在一定的序列差異，也和它們的功能結(jié)構(gòu)差異相對應(yīng)。同時(shí)，ptc-miR393 與PtFBL3、PtFBL4的反向互補(bǔ)序列同源相似度最高，其次是與PtFBL1、PtFBL2，與PtFBL5、PtFBL6以及PtFBL7、PtFBL8相似度較差（圖4a）。將ptc-miR393 成熟體序列與楊樹FBL基因家族成員的核酸序列進(jìn)行配對比較，發(fā)現(xiàn)PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4與ptc-miR393 的互補(bǔ)配對率較高，只有2 ～3 個(gè)堿基的差異，并且是在ptc-miR393 的3′末端區(qū)域。而PtFBL5、PtFBL6、PtFBL7和PtFBL8與ptcmiR393 有5 ～7 個(gè)堿基差異，且在ptc-miR393 的5′端前10 個(gè)堿基就有1 ～2 個(gè)堿基差（圖4b）。根據(jù)ptc-miR393 與FBL基因的堿基配對差異，推測PtFBL1-PtFBL4受ptc-miR393 的剪切調(diào)控，而PtFBL5-PtFBL8不受ptc-miR393 的剪切。

圖4 楊樹FBL1-8 基因與ptc-miR393 核酸序列的比對Fig.4 Nucleic acid sequence alignment of poplar FBL1-8 gene and ptc-miR393

2.4 楊樹miR393 與FBL 家族基因的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)楊樹miR393 對FBL基因家族成員的調(diào)控作用，對ptc-miR393 與FBL家族基因在楊樹不同發(fā)育時(shí)期的不同組織中進(jìn)行表達(dá)分析。如圖5 所示，PtFBL3和PtFBL4的表達(dá)模式一致，與PtFBL2的表達(dá)趨勢也比較相似，但與PtFBL1的表達(dá)模式存在較大差異。PtFBL1在楊樹1 個(gè)月的組培苗的根、莖、葉中高表達(dá)，而PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4是在組培苗的葉片和莖中高表達(dá)。PtFBL1—PtFBL4在楊樹3 個(gè)月的土培苗中都表現(xiàn)出相似的表達(dá)趨勢，特別在幼嫩的組織中高表達(dá)，比如在未展開葉片及頂端分生組織；同時(shí)隨著莖間數(shù)的增多，PtFBL1—PtFBL4的表達(dá)量逐漸降低。相反，ptc-miR393 在楊樹幼嫩的組織中表達(dá)量都比較低，特別是楊樹組培苗的組織。在3 個(gè)月的土培苗中，ptc-miR393 的表達(dá)量從頂端分生組織到莖基部逐漸增多，與PtFBL1—PtFBL4呈相反的表達(dá)模式。PtFBL7、PtFBL8與PtFBL1—PtFBL4表達(dá)模式有所不同，它們在土培苗中不同的莖段和未展開葉中都高表達(dá)，在15 d組培苗的葉片和莖中表達(dá)量也較高。而PtFBL5和PtFBL6只在土培苗中的不同節(jié)間和根中高表達(dá)，在組培苗中的表達(dá)量都較低。從ptc-miR393 與PtFBL1—PtFBL8基因在楊樹不同發(fā)育時(shí)期和組織中的表達(dá)模式可以看出，PtFBL1—PtFBL4的表達(dá)與ptc-miR393 呈相反的趨勢，而PtFBL5—PtFBL8的表達(dá)不受ptc-miR393 的影響，說明PtFBL1—PtFBL4可能受ptc-miR393 直接調(diào)控。為了驗(yàn)證這一推測，分別對PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3、PtFBL4、PtFBL5、PtFBL6、PtFBL7和PtFBL8進(jìn)行了5′-RACE 的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4經(jīng)過兩輪巢式PCR 產(chǎn)物的克隆測序，都能檢測到有明確的ptc-miR393剪切位點(diǎn)（圖6），而PtFBL5、PtFBL6、PtFBL7和PtFBL8經(jīng)過二輪巢式PCR 后都未獲得目標(biāo)長度的片段，說明它們不受ptc-miR393 的剪切調(diào)控。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

miR393 的靶基因是FBL基因家族。楊樹FBL基因家族共有8 個(gè)不同成員，兩兩成員之間的同源性較高。PtFBL1—PtFBL4之間具有較高的同源 性， 而PtFBL5、PtFBL6和PtFBL7、PtFBL8分別位于不同的分支且與PtFBL1—PtFBL4的同源關(guān)系較遠(yuǎn)，并且它們的結(jié)構(gòu)域有一定的改變。ptc-miR393 與PtFBL1—PtFBL4的互補(bǔ)配對率較高，與PtFBL5—PtFBL8之間有5 ～7 個(gè)堿基的差異，通過組織表達(dá)分析和5′-RACE 檢測，驗(yàn)證出PtFBL1—PtFBL4是ptc-miR393 的靶基因，而PtFBL5—PtFBL8不受ptc-miR393 的剪切調(diào)控。

圖5 楊樹miR393 與FBL 家族基因在不同發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá)Fig.5 The expression of miR393 and FBLfamily genes in poplar tissues at different developmental stages

圖6 楊樹FBL1-8 基因的5′-RACE 驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Results of 5′-RACE validation of FBL1-8 genes

3.2 討 論

楊 樹ptc-miR393 與PtFBL1—PtFBL4的互補(bǔ)配對率較高，而與PtFBL5—PtFBL8之間有5 ～7個(gè)堿基差異，并且PtFBL5和PtFBL6在第11 個(gè)堿基處有錯(cuò)配。根據(jù)植物miRNA 與靶基因的配對原則，miRNA 與靶基因不得有超過4 個(gè)堿基的錯(cuò)配，并在5′端的第10 或11 位點(diǎn)不得有堿基錯(cuò)配；miRNA 與靶基因結(jié)合的種子序列（miRNA 5′端起的第1 ～12 個(gè)堿基）不得有相鄰位點(diǎn)及超過2.5 個(gè)堿基的錯(cuò)配[25-26]。推測PtFBL1—PtFBL4基因可能受ptc-miR393 的調(diào)控，而PtFBL5—PtFBL8則不受其調(diào)控。進(jìn)一步通過ptc-miR393 和FBL基因家族成員的組織表達(dá)模式以及PtFBL1-8基因的5′-RACE 檢測，驗(yàn)證出PtFBL1、PtFBL2、PtFBL3和PtFBL4受到ptc-miR393 的剪切，可以確定是ptc-miR393 的靶基因。已有研究表明，與楊樹PtFBL1—PtFBL4同源的擬南芥AtTIR1、AtAFB1、AtAFB2、AtAFB3基因和水稻OsTIR1與OsAFB2基因都受到miR393 的調(diào)控[6,11]。說明miRNA 與靶基因之間的堿基配對率會(huì)直接影響miRNA 對靶基因的作用效果。

從FBL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹上可以看出，受到miR393 調(diào)控的FBL成員都聚類在一個(gè)分支上，并且它們在miR393 的結(jié)合位點(diǎn)處有相同的序列，推測它們可能在植物發(fā)育過程中具有相似的作用和功能。相反，楊樹PtFBL5—PtFBL8基因都不受ptc-miR393 的剪切調(diào)控。PtFBL7和PtFBL8與擬南芥和水稻的FBL基因聚在一起，而PtFBL5和PtFBL6卻單獨(dú)和小黎碗蘚的FBL基因聚類，且表達(dá)模式也與楊樹其他FBL基因不一樣，說明PtFBL5—PtFBL8的生物學(xué)功能可能與PtFBL1—PtFBL4不同。 此外，PtFBL1—PtFBL4基因的剪切位點(diǎn)位于FBL基因關(guān)鍵的F-box、ANN superfamily1、ANN superfamily2 結(jié)構(gòu)域之后，說明PtFBL1-PtFBL4受到ptc-miR393 剪切后，其5′端主要的結(jié)構(gòu)域就會(huì)被降解，因此ptc-miR393 對PtFBL1—PtFBL4的調(diào)控作用較強(qiáng)。

本研究從FBL基因家族的物種進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)分析以及與ptc-miR393 之間調(diào)控作用的鑒定等方面進(jìn)行研究，揭示了ptc-miR393 與楊樹FBL基因家族成員間的剪切作用。這為進(jìn)一步研究ptc-miR393 和FBL基因的生物學(xué)功能，以及揭示ptc-miR393 與楊樹FBL基因之間的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。