不同處方配比及提取工藝對銀柴退熱湯解熱鎮(zhèn)痛抗菌抗炎作用的影響

譚麗媛，翟康欣，遆安航，陳 瑾，張淑蓉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

賈氏銀柴退熱湯是首屆全國名中醫(yī)賈六金主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方，處方為銀翹散、小柴胡湯組方加減而來，由金銀花、柴胡、連翹、黃芩等14 味中藥組成，具有辛涼解表、清熱解毒、利咽透邪之功效，治療小兒急性上呼吸道感染療效顯著［1-2］。全方無貴重藥物，用藥易得，南北通用，真正做到了價廉效驗，具有廣泛的應(yīng)用和開發(fā)前景。中醫(yī)臨床用藥特點為辨證施治，常因人、因癥而調(diào)整處方藥量，在將經(jīng)驗方開發(fā)成新的中藥制劑時，確定處方的配比至關(guān)重要?，F(xiàn)代藥理研究表明，揮發(fā)油具有抑菌、發(fā)汗、理氣、止痛、鎮(zhèn)靜等藥理作用，方中金銀花、連翹、柴胡、黃芩等7 味藥材中均含有揮發(fā)油［3-6］。本實驗利用大、小鼠的藥理學(xué)模型，考察不同處方配比及提取工藝對銀柴退熱湯流浸膏抗菌解熱抗炎鎮(zhèn)痛作用的影響，為后期銀柴退熱湯的開發(fā)應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 金銀花、連翹、柴胡、黃芩等14 味藥材購于安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司、河北全泰藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室裴香萍副教授鑒定，均為2015 版《中國藥典》收載品種，符合2015 版《中國藥典》一部相關(guān)項下要求。硫酸慶大霉素注射液（批號：H41020366，天方藥業(yè)有限公司）；氯化鈉注射液（批號：D14072305，山東華魯制藥有限公司）；Mueller-Hinton 瓊脂（HB6232，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（批號：20131218，北京博興生物技術(shù)有限公司）；阿司匹林腸溶片（批號：20150601，山西同達藥業(yè)有限公司）；干酵母粉（批號：GB/T20886，安琪酵母股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（批號：20161210，重慶力宏精細(xì)化工有限公司）；Tween-80 等試劑均為分析純。金黃色葡萄球菌由山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 儀器與動物 DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；CZB1001 電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；LMQR-32608 立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；DC 超凈工作臺（濟南安暢醫(yī)療設(shè)備有限公司）；THZ-D 空氣恒溫振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）等。SD大鼠、昆明（KM）小鼠均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2014-0013。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 水煎煮法：按照金銀花：柴胡配比為1∶1、2∶1、1∶2 稱取藥材，加入10 倍量水，煎煮2 次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，即得供試品溶液1、2、3，放置備用。

雙提法：按照金銀花：柴胡配比為1∶1、2∶1、1∶2稱取含揮發(fā)油藥材，加10 倍量水，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油4 h，蒸餾后的水溶液另器收集；藥渣與剩余藥材加入10 倍量的水，煎煮2 次，每次30 min，合并煎液與上述水溶液，濾過，減壓濃縮至適量，加入揮發(fā)油，制成生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL 的溶液，即得供試品溶液4、5、6，放置備用。

1.2.2 抗菌實驗 采用K-B 紙片擴散法，設(shè)置陰性對照組（生理鹽水）、慶大霉素組、供試品溶液1～6 組，取6 mm 的無菌濾紙片分別滴加生理鹽水、40 μg/mL 慶大霉素、1.00 mg/mL 供試品溶液1～6，各25 μL，揮干溶劑制成藥敏片。取20 μL 金黃色葡萄球菌最適菌懸液10-2CFU/mL 于無菌平板，迅速涂布均勻，放入制備好的藥敏片，置37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，重復(fù)3 次，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值［3］。

1.2.3 解熱實驗 取SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，連續(xù)測肛溫3 d，使大鼠適應(yīng)此操作。實驗當(dāng)日每隔1 h 測體溫1 次，連續(xù)3 次，選取體溫在36.6 ℃～38.1 ℃且體溫變化不超過0.3 ℃的大鼠供制備發(fā)熱模型用。體溫合格的大鼠禁食12 h，背部皮下注射10 %干酵母混懸液5 mL/kg，每隔1 h 測肛溫1 次。8 h 后大鼠體溫上升達高峰，選取體溫上升1 ℃以上的大鼠供實驗用。經(jīng)篩選后取發(fā)熱大鼠48 只，雌雄各半，隨機分為8 組，每組6 只，分別為模型組、阿司匹林組、供試品1～6 組。 模型組灌胃等體積生理鹽水、阿司匹林組灌胃等體積阿司匹林（0.1g/kg），給藥組分別灌胃供試品溶液1～6（供試品1、4：22.62 g/kg，供試品2、3、5、6：24.34 g/kg，相當(dāng)于人臨床給藥量的2 倍）。給藥后每隔1 h 測體溫1 次，連續(xù)6 次，計算體溫變化值［7-8］。

1.2.4 抗炎實驗 取SD 大鼠64 只，雌雄各半，隨機分為8 組，每組8 只，分別為模型組、阿司匹林組、供試品1～6 組。分組后正常飼養(yǎng)，連續(xù)灌胃5 d，每天1 次，模型組灌胃等體積生理鹽水、阿司匹林組灌胃等體積阿司匹林（0.1 g/kg），給藥組分別灌胃供試品溶液1～6（供試品1、4：22.62 g/kg，供試品2、3、5、6：24.34 g/kg，相當(dāng)于人臨床給藥量的2 倍）。末次給藥后測量記錄大鼠右后足體積，隨后用10%的雞蛋清溶液注射于大鼠踝關(guān)節(jié)處，0.1 mL/只，建立雞蛋清致大鼠足腫脹炎癥模型。分別記錄注射后0.5 h、2 h、4 h 時大鼠右后足體積［7-8］。以注射前后大鼠右后足體積差值計算足腫脹度，并計算各組大鼠足腫脹的抑制率。腫脹度抑制率=（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）/模型組腫脹度×100%。

1.2.5 鎮(zhèn)痛實驗 取KM 小鼠80 只，雌雄各半，隨機分為8 組，每組10 只，分別為模型組、阿司匹林組、供試品1～6 組。分組后正常飼養(yǎng)，連續(xù)灌胃7 d，1 次/d，模型組灌胃等體積生理鹽水、陽性組灌胃等體積阿司匹林（0.1g/kg），給藥組分別灌胃供試品溶液1～6（供試品1、4：33.94 g/kg，供試品2、3、5、6：36.52 g/kg，相當(dāng)于人臨床給藥量的2倍）。末次給藥后60 min，每只小鼠腹腔注射新鮮配制的0.5%醋酸溶液0.3 mL，觀察并記錄15 min 內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)（以腹部內(nèi)凹、軀干與后腿伸展、臂部高起為陽性反應(yīng)），計算各組對扭體反應(yīng)的抑制率。抑制率=（模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/模型組扭體次數(shù)×100 %。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌實驗

生理鹽水無抑制作用，慶大霉素和供試品1～6對金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？菇瘘S色葡萄球菌活性為慶大霉素＞供試品6＞供試品5＞供試品2＞供試品4＞供試品3=供試品1＞生理鹽水。供試品4～6 抗菌活性整體優(yōu)于供試品1～3，說明雙提法制備的供試品抑菌效果更好；金銀花：柴胡3種不同配比中，抗菌強弱無明顯差異。結(jié)果見表1。

2.2 解熱實驗

供試品1 組在給藥后1 h，供試品4 組在給藥后4 h，供試品5 組在給藥后1 h、4 h、5 h，供試品6 組在給藥后4 h、5 h，體溫降低值與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。供試品4～6 解熱作用整體優(yōu)于供試品1～3，說明雙提法制備的供試品解熱效果更好；金銀花：柴胡3 種不同配比中，解熱作用無明顯差異。結(jié)果見表2。

表1 賈氏銀柴退熱湯不同提取物對金黃色葡萄球菌活性的影響 （±s）

表1 賈氏銀柴退熱湯不同提取物對金黃色葡萄球菌活性的影響 （±s）

注：與陰性對照組比較，1）P＜0.05

組別 抑菌圈直徑（mm）陰性對照組 6.00±0.00慶大霉素組 19.58±0.011）供試品1 組 11.17±0.181）供試品2 組 13.25±0.491）供試品3 組 11.17±0.571）供試品4 組 12.25±0.411）供試品5 組 14.75±0.321）供試品6 組 15.42±0.091）

2.3 抗炎實驗

供試品1 組在注射后0.5 h、2 h，供試品2 組在注射后0.5 h、2 h、4 h，供試品6 組在注射后2 h，致炎后腫脹度與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。供試品4～6 組腫脹抑制率整體高于供試品1～3 組，說明雙提法制備的供試品抗炎效果更好；金銀花：柴胡3 種不同配比中，抗炎作用無明顯差異。結(jié)果見表3。

2.4 鎮(zhèn)痛實驗

供試品1 組、4 組小鼠扭體次數(shù)與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明金銀花∶柴胡3 種不同配比中，配比為1∶1 鎮(zhèn)痛作用最強。

表2 賈氏銀柴退熱湯提取物對干酵母所致大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響 （±s）

表2 賈氏銀柴退熱湯提取物對干酵母所致大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05

組別 n 劑量（g/kg） 致熱后體溫（℃） 給藥后體溫降低值（℃）1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h模型組 6 - 40.03±0.15 0.30±0.22 0.66±0.24 0.72±0.40 0.82±0.40 1.10±0.42 1.12±0.40阿司匹林組 6 0.10 39.97±0.01 1.20±0.161） 1.55±0.26 2.00±0.50 2.40±0.231） 2.56±0.201） 0.34±0.16供試品1 組 6 22.62 39.64±0.05 1.10±0.201） 1.04±1.33 0.80±0.48 1.03±0.70 1.54±0.39 1.79±1.15供試品2 組 6 24.34 39.86±0.24 0.43±0.51 1.17±0.32 0.11±0.02 0.57±0.30 0.78±0.20 0.51±0.09供試品3 組 6 24.34 40.12±0.05 0.73±0.19 1.35±0.22 0.89±1.50 0.81±0.12 1.27±0.11 0.60±0.42供試品4 組 6 22.62 40.06±0.06 0.24±0.08 1.57±0.23 1.50±1.05 1.62±0.171） 1.35±0.39 1.27±0.58供試品5 組 6 24.34 40.04±0.04 0.96±0.161） 1.15±0.09 1.21±1.30 1.55±0.511） 1.70±0.421） 2.16±1.45供試品6 組 6 24.34 39.96±0.05 0.82±0.57 1.45±0.04 1.66±0.09 1.95±0.231） 2.18±0.181） 1.34±0.09

表3 賈氏銀柴退熱湯提取物對蛋清致大鼠足腫脹的影響

結(jié)果見表4。

表4 賈氏銀柴退熱湯提取物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3 討 論

臨床研究證實，賈氏銀柴退熱湯對小兒急性上呼吸道感染療效確切［1-2］，但現(xiàn)階段缺少藥理實驗研究證實。本研究發(fā)現(xiàn)，賈氏銀柴退熱湯具有一定的抗菌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛作用，為后期賈氏銀柴退熱湯的開發(fā)應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。不同處方配比對解熱抗菌抗炎作用影響不大，對鎮(zhèn)痛作用有一定影響，金銀花：柴胡為1∶1 時，鎮(zhèn)痛作用較明顯。提取方法對解熱鎮(zhèn)痛抗菌抗炎作用均有一定影響，雙提法提取時藥理作用更明顯。最終，我們確定處方配比金銀花：柴胡為1∶1，提取方法為雙提法進行后續(xù)實驗。