酸性KMnO4-HCHO化學發(fā)光體系檢測硫酸慶大霉素注射液中硫酸慶大霉素的含量

楊 榮，顏雪梅，汪燕飛，熊昌美，龍星宇,2*

(1.貴州師范大學 化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550025；2.中科院地球化學研究所 環(huán)境地球化學重點實驗室，貴州 貴陽 550081)

0 引言

硫酸慶大霉素(Gentamicin(GM) sulphate，GMS，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示)，是廣泛應(yīng)用的氨基糖苷類廣譜抗生素，由于是與細菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。對多種革蘭陰性菌及陽性菌都具有抑菌和殺菌作用，尤其是對產(chǎn)氣桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、沙門氏菌屬及變形桿菌等金葡菌和革蘭陰性菌等作用較強[1]。具有療效好、廣譜性、價格便宜、能抑制多種細菌的生長、細菌對該藥的耐藥性發(fā)生率較低等優(yōu)點，是獸醫(yī)臨床治療中較為安全的抗生素之一[2]。其不良反應(yīng)比鏈霉素、卡那霉素少，所以目前臨床應(yīng)用仍然較為廣泛[3]。其注射劑、口服片劑等常常被應(yīng)用于臨床，一些醫(yī)療機構(gòu)還開發(fā)出口服溶液等用于治療胃及十二指腸潰瘍病、腸炎和痢疾等。盡管GM抗菌譜廣，但有效治療濃度范圍狹窄，易發(fā)生毒副反應(yīng)，為臨床安全有效用藥，精確測定其在制劑中含量非常重要[4]。

圖1 硫酸慶大霉素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Gentamicin sulphate (GMS)

目前測定硫酸慶大霉素的方法有光度法[5-7]、濁度法[8]、反相離子對色譜-脈沖安培電化學法[9]、HPLC-ELSD法[10]、離子色譜法[11]、流動注射電化學發(fā)光分析法[12]、UPLC-QTOF-MS聯(lián)用技術(shù)法[13]等，這些建立的硫酸慶大霉素的分析方法，或靈敏度不高，或儀器設(shè)備比較昂貴，適用范圍受限。因具有儀器設(shè)備簡單易操作，靈敏度高，線性范圍寬等特點，流動注射化學發(fā)光分析法被廣泛地應(yīng)用到藥物、食品、環(huán)境等領(lǐng)域中[14-18]。

預(yù)實驗表明，在酸性介質(zhì)中，高錳酸鉀可以氧化硫酸慶大霉素產(chǎn)生微弱的化學發(fā)光現(xiàn)象，但發(fā)光效率較低，信號較弱，作為增敏劑，在甲醛的存在下，可以大大增強該反應(yīng)的化學發(fā)光強度。據(jù)此，建立了甲醛-酸性高錳酸鉀體系測定硫酸慶大霉素的流動注射化學發(fā)光分析方法。該方法重現(xiàn)性好，精密度高，并將該方法應(yīng)用于硫酸慶大霉素注射液中含量的測定，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

BPCL-1-TIC型流動注射化學發(fā)光體系儀器(北京物理化學分析儀器有限公司)；IFIS-D型智能流動注射進樣器(西安瑞邁分析儀器有限公司)；FA2004型電子天平(精確至0.1 mg，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.1.2 試劑

甲醛(分析純，無錫市亞盛化工有限公司)、高錳酸鉀(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)、硫酸(98%)、硫酸慶大霉素注射液(1 mL∶0.2 g，山西省芮城科龍獸藥有限公司)，實驗用水為去離子水。

1.2 溶液配制

硫酸慶大霉素標準儲備液(10 mg/mL)：硫酸慶大霉素注射液標示含量為0.2 g/mL，準確移取5.0 mL至100 mL容量瓶中，準確定容，配制為10 mg/mL的溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

硫酸的標準儲備液(2.0 mol/L)：準確移取55.56 mL 98%的濃硫酸至500 mL容量瓶中，準確定容，配制成2.0 mo/L的溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醛的工作液(4%)：取66 mL 30.03%的甲醛，稀釋后，將其移至500 mL容量瓶中，準確定容，配制成4%的甲醛溶液，保存?zhèn)溆?，現(xiàn)用現(xiàn)配。

高錳酸鉀的標準儲備液(約5×10-2mol/L)：稱取3.950 7 g高錳酸鉀固體，在燒杯中溶解，配制定容于500 mL容量瓶中，準確定容，保存?zhèn)溆?。特別說明的是：由于高錳酸鉀物質(zhì)不純，里面含得有MnO2等雜質(zhì)，故需要標定，我們采用大約的濃度表示。以下所涉及到所使用高錳酸鉀濃度時，均以此儲備液濃度下(約5×10-2mol/L)作逐級稀釋。酸性高錳酸鉀溶液臨用時現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗方法

圖2為硫酸慶大霉素的BPCL-1-TIC型流動注射化學發(fā)光法示意圖。通過自動泵將A管通路的甲醛與B管通路的酸性高錳酸鉀溶液(內(nèi)含硫酸)先在線混合反應(yīng)，再通C管路中用水做載液將S通路中的硫酸慶大霉素泵入混合點后，進入流通池F，由光電倍增管(PMT)將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，通過檢測器檢測電信號，最終傳輸至個人電腦(PC)由電腦記錄光譜信號圖，對化學發(fā)光信號進行采集。設(shè)定儀器參數(shù)，自動進樣，由記錄儀記錄發(fā)光信號，以平行3次測定發(fā)光強度結(jié)果求平均(n=3)。由于硫酸慶大霉素對甲醛-酸性高錳酸鉀溶液有明顯的增敏作用，且硫酸慶大霉素濃度(c)與增敏的相對發(fā)光強度(ΔI)成正比，由此展開實驗操作。

P1，P2：蠕動泵；V：進樣閥；W：廢液；F：流通池；PMT：光電倍增管(PMT)；PC：電腦；A：甲醛溶液；B：酸性高錳酸鉀(含硫酸)；C：載液(水)；S：硫酸慶大霉素圖2 流動注射-化學發(fā)光測定硫酸慶大霉素的流路示意圖Fig.2 Schematic diagram of the flow injection chemiluminescencedetermination of Gentamicin sulphate

2 結(jié)果與討論

2.1 化學發(fā)光反應(yīng)動力學性質(zhì)

實驗中我們通過自動泵注入試劑混合液，通過儀器檢測化學發(fā)光動力學曲線，所得結(jié)果如圖3所示。我們先通入甲醛和酸性高錳酸鉀產(chǎn)生穩(wěn)定的化學發(fā)光曲線后，我們再通入硫酸慶大霉素，其發(fā)光信號顯著增強，并在3 s左右達到了最大發(fā)光強度，整個化學發(fā)光持續(xù)了10 s左右的時間(見圖3b)。從化學發(fā)光反應(yīng)動力學說明了甲醛-酸性高錳酸鉀發(fā)光體系具有快速發(fā)光的特點。

圖3 化學發(fā)光動力學曲線 a)甲醛+酸性高錳酸鉀；b)甲醛+酸性高錳酸鉀+硫酸慶大霉素Fig.3 The kinetic curve of the Chemiluminescence reactiona) KMnO4-HCHO; b) KMnO4-HCHO-GMS

2.2 條件優(yōu)化考察

2.2.1 流動注射化學發(fā)光儀參數(shù)條件的選擇

啟動儀器，儀器預(yù)先預(yù)熱15 min以上，并將光電倍增管參數(shù)設(shè)置為1 000 Pa，并對智能自動注射進樣器的參數(shù)進行設(shè)置。當步號為0時，此時對應(yīng)的為取樣階段，蠕動泵主泵數(shù)及副泵數(shù)均為60，主泵方向及副泵方向均為正轉(zhuǎn)，A閥位為手動，B閥位為右，運行時間為100 s，重復次數(shù)為1，重復起點為0；當步號為1時，此時對應(yīng)的為進樣階段，蠕動泵主泵數(shù)及副泵數(shù)參數(shù)均為60，主泵方向及副泵方向均為正轉(zhuǎn)，A閥位為手動，B閥位為左，運行時間為20 s，重復次數(shù)為99(有助于每次都可以進行進樣，優(yōu)化條件時不會產(chǎn)生停泵的現(xiàn)象)，重復起點為0。在此參數(shù)下運行，能快速地進行化學發(fā)光反應(yīng)，且所得譜圖時間合理，即前一次進樣后發(fā)光反應(yīng)完全且發(fā)光信號完全返回至基線后，再進行下一次進樣，兩次進樣所得的并不相互影響。

2.2.2 不同條件對相對化學發(fā)光信號的影響

甲醛-高錳酸鉀發(fā)光體系中，必需在酸性條件下進行反應(yīng)。因此，我們首先考察不同濃度的硫酸對化學發(fā)光信號強度的影響?？疾炝蛩嵩?.1～1.2 mol/L范圍內(nèi)，化學發(fā)光體系的化學發(fā)光信號影響。隨著硫酸濃度的升高，相對化學發(fā)光強度逐漸增大，而達到1.0 mol/L之后，相對化學發(fā)光強度又隨著濃度減小(見圖4A)。當濃度超過1.0 mol/L后，變化不明顯，且對管路有腐蝕，不利于后續(xù)的實驗研究。因此選擇了1.0 mol/L的硫酸為最優(yōu)的濃度。

高錳酸鉀作為氧化劑，其濃度是一個重要因素，對該化學發(fā)光體系有明顯的影響。選定1.0 mol/L硫酸的條件下，我們進一步考察了高錳酸鉀濃度為5×10-3mol/L、1×10-4mol/L、3×10-4mol/L、5×10-4mol/L和7×10-4mol/L時對化學發(fā)光強度的影響(見圖4B)。由圖3B可知，3×10-4mol/L高錳酸鉀濃度時，可以獲得最大相對發(fā)光強度。

分別考慮不同甲醛濃度，在0.5%～5%范圍內(nèi)對體系的相對化學發(fā)光強度，結(jié)果見圖4C所示。結(jié)果表明，隨著甲醛濃度不斷增加，相對化學發(fā)光強度也增強。當甲醛濃度超過4%時，相對發(fā)光強度增大不明顯。因此，選擇4%甲醛濃度作為最佳濃度。

由于甲醛-酸性高錳酸鉀-硫酸慶大霉素化學發(fā)光體系中，該體系是一個快速的發(fā)光反應(yīng)。當兩種溶液混合后，如果泵速過慢的話，最大化學發(fā)光強度會在檢測器之前；泵速過快的話，最大化學發(fā)光強度在檢測器之后，不管泵速過慢還是過快，在檢測器處均未能檢測到最大化學發(fā)光信號強度。因此，選擇合適的泵速直接影響著可檢測到的化學發(fā)光信號強度。我們通過設(shè)置參數(shù)的不同來代替泵速的不同，分別考察了自動進樣裝置中泵速參數(shù)為20、30、40、50、60、70、80、90時對化學發(fā)光強度的影響，在參數(shù)為20時，基線不是太穩(wěn)定，參數(shù)在60以后數(shù)值增加得并不是很明顯，但是總體上隨著參數(shù)的增加，化學發(fā)光強度也隨之增加，結(jié)果如圖3D所示。本著節(jié)省試劑經(jīng)濟的目的，因此，我們最終選擇最佳泵速設(shè)置參數(shù)為60。

圖4 不同條件對相對化學發(fā)光強度的影響硫酸A)；高錳酸鉀B)；甲醛濃度C)；蠕動泵泵速D)Fig.4 Effect relative chemiluminiscence intense on different conditionsH2SO4 (A); KMnO4 (B); HCHO (C); Flow rate for peristaltic pump (D)

2.3 線性方程、精密度及檢出限

在以上優(yōu)化條件的選擇下，即在濃度為1 moL/L的硫酸介質(zhì)，當高錳酸鉀濃度為3×10-4moL/L，甲醛濃度為4%，蠕動泵流速設(shè)置為60的條件下，化學發(fā)光強度在硫酸慶大霉素(GMS)濃度范圍為5.0×10-5～5.0×10-4g/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系ΔI=3.338 24c-7.379 34(R2=0.995 3)，結(jié)果見圖5所示。以3倍的信噪比計算，方法最低檢出限為1.5×10-5g/mL，并對3.0×10-4g/mL的硫酸慶大霉素(GMS)連續(xù)測定10次(見圖6)，其相對標準偏差(RSD)為1.4%。說明該方法簡單、可靠。

圖5 硫酸慶大霉素標準曲線Fig.5 Calibration curve of GMS

圖6 10次連續(xù)測定3.0×10-4 g/mL硫酸慶大霉素的化學發(fā)光響應(yīng)特性曲線Fig.6 Chemiluminescence response signal on sequential determination 10 times for 3.0×10-4 g/mL GMS

2.4 干擾實驗

2.5 硫酸慶大霉素注射液樣品分析

硫酸慶大霉素(GMS)注射液主要成分是硫酸慶大霉素(GMS)，主要用于治療敏感的革蘭氏陰性和陽性菌感染，如敗血癥、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、胃腸道感染、腹膜炎、膽道感染、乳腺炎及皮膚和軟組織感染以及傳染性鼻炎等[6]。按照標準樣品溶液配制方法，將0.2 g/mL硫酸慶大霉素注射液分別配制成1.0×10-4g/mL和2.0×10-4g/mL兩種不同濃度的樣品作為基底含量，并分別對其進行加標回收測定。加標的原則為基底濃度的0.5倍、0.8倍和1.0倍，即在1.0×10-4g/mL的樣品中分別添加0.5×10-4g/mL、0.8×10-4g/mL和1.0×10-4g/mL；2.0×10-4g/mL的樣品中添加0.5×10-4g/mL、0.8×10-4g/mL、1.0×10-4g/mL，確保加標后的濃度均在線性范圍內(nèi)。測定結(jié)果如表1所示。兩種人工制成的樣品的加標回收率在96.1%～100.3%之間，相對偏差(RSD)在0.3%～3.1%之間。這說明我們所建立的新的流動注射化學發(fā)光分析方法可以用于硫酸慶大霉素注射液中硫酸慶大霉素的測定，結(jié)果準確，方法簡便可靠。

表1 硫酸慶大霉素(GMS)注射液加標回收測定結(jié)果(n=5)Tab.1 Analysis results of determination of GMS in GMS injection (n=5)

3 結(jié)論

基于酸性條件下，建立流動注射-甲醛增敏的高錳酸鉀化學發(fā)光體系測定硫酸慶大霉素的新方法。硫酸慶大霉素在5.0×10-5～5.0×10-4g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2=0.995 3，方法檢測限為1.5×10-5g/mL(S/N=3)，并對3.0×10-4g/mL的硫酸慶大霉素連續(xù)測定10次，其相對標準偏差(RSD)為1.4%。并將該方法用于硫酸慶大霉素注射液中硫酸慶大霉素含量的測定，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果令人滿意。也為硫酸慶大霉素的測定提供了一種新型的簡便方法途徑。