肉牛源細(xì)極鏈格孢菌的分離鑒定

彭 彥，楊 超，姜堯章，馬曉平，申紀(jì)饒，胡 靜，古 玉，彭廣能，鐘志軍，左之才

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2. 四川水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611231；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，四川 成都 611130）

肉牛真菌性皮膚病主要是由皮膚癬菌感染引起的一類(lèi)接觸傳染性較強(qiáng)的人畜共患病，可繼發(fā)引起多種患病動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能以及機(jī)體抵抗力下降等，常給養(yǎng)牛業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。近年已報(bào)道的肉牛皮膚真菌病有由毛孢子菌屬導(dǎo)致的肉牛皮膚大面積脫毛[1]；感染小芽胞癬菌引起的銅錢(qián)癬、痂癬；感染疣狀毛癬菌引起的犢牛全身性感染脫毛。肉牛皮膚真菌病在國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在臨床診療上，而對(duì)病原真菌的分類(lèi)、致病性和耐藥性研究較少。

細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）是屬于半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科、鏈格孢屬的一種廣泛存在于自然界的腐生絲狀條件致病菌，可引起植物、動(dòng)物和人患病。

迄今為止，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約500種鏈格孢屬真菌且仍不斷有新種發(fā)現(xiàn)，雖然其95%寄生于植物但仍存有5%對(duì)動(dòng)物和人致病。有些鏈格孢菌可以感染人和動(dòng)物，引起手足等皮膚及皮膚深部真菌病[2]；有研究曾多次從兒童皮癬組織中分離到一種類(lèi)似侵染鏈格孢的真菌[3]。這些鏈格孢屬真菌可以引起兒童不同程度的脫毛、皮屑增多、瘙癢等癥狀；甚至可導(dǎo)致免疫力低下的動(dòng)物患鏈格孢屬深部真菌病。張芝元等從健康犬體表分離出21 株鏈格孢屬真菌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬為犬體表的優(yōu)勢(shì)種，廣泛分布于犬耳背、臉頰、背部及后腿內(nèi)側(cè)等多個(gè)部位[4]。鏈格孢屬真菌在一定條件下可使動(dòng)物不同程度感染，而國(guó)內(nèi)外目前少有關(guān)于動(dòng)物細(xì)極鏈格孢菌引起的皮膚真菌病及其致病性的研究?；诖吮緦?shí)驗(yàn)采集疑似為皮膚真菌病（自然發(fā)?。┑娜馀２∽儾课黄ば?、毛發(fā)和痂皮分離病原真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析鑒定該菌株為細(xì)極鏈格孢菌，并以此為基礎(chǔ)研究該菌對(duì)小鼠的致病性和篩選敏感藥物，以期為細(xì)極鏈格孢菌引起的皮膚真菌病的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 27 只20 g～24 g 體況相近的6 周齡～8 周齡的健康SPF 級(jí)KM 小鼠（雌雄不限），購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。酵母基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）、溶壁酶Lyticase、DL 2000 DNA Marker 和2×Taq PCR Master Mix 購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司；放線菌酮購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司；氯霉素購(gòu)自北京索萊寶科技公司；酮康唑、灰黃霉素購(gòu)自上海源葉生物科技公司；伊曲康唑、氟康唑購(gòu)自上海瑞永生物科技公司。

1.2 患病肉牛臨床表現(xiàn)及病料樣品采集 某養(yǎng)殖場(chǎng)23 頭肉牛頭頸部局部出現(xiàn)不同程度的脫毛脫屑和皮癬，嚴(yán)重部位呈團(tuán)塊狀脫毛，患部瘙癢常與周?chē)矬w等摩擦出現(xiàn)紅疹。其余精神食欲正常。

用75%酒精消毒肉牛頭、頸、背等皮膚脫毛區(qū)域，再用無(wú)菌刀片在病健結(jié)合部刮至微出血，用無(wú)菌鑷子取其皮屑、毛發(fā)、痂皮少許分別放于無(wú)菌密封袋中并編號(hào)，放入4 ℃的保溫箱送實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，最后20 g/L 碘酊對(duì)取樣處消毒。

1.3 真菌分離及純化培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[5]方法對(duì)收集病料鏡檢觀察。同時(shí)取少量毛發(fā)或皮屑用滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗3 次以后，用滅菌濾紙吸干，采用3 點(diǎn)接種法平行接種至含有放線菌酮和氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）中25 ℃培養(yǎng)7 d，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，將形態(tài)不同的單個(gè)菌落分別接種到新的普通SDA 培養(yǎng)基中于25 ℃培養(yǎng)7 d，用銅圈培養(yǎng)法（用融化的石蠟將直徑約1.5 cm，高度為3 mm，側(cè)面有一小孔的銅圈粘在載玻片上，蓋上蓋玻片，將SDA 培養(yǎng)基滅菌后用注射器注入銅圈使其形成很小的斜面，用接種針將分離真菌通過(guò)小孔接種斜面上）培養(yǎng)以觀察菌絲和孢子形態(tài)，經(jīng)棉蘭染色后經(jīng)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.4 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定 取分離株在SDA培養(yǎng)基中純化后提取病原基因組。采用ITS 區(qū)通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'/ITS4 5'-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3'PCR 擴(kuò) 增ITS 基 因，引 物由成都擎科梓熙生物技術(shù)公司合成。PCR 產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI中BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用MEGA-X 建立該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 小鼠致病性試驗(yàn) 利用無(wú)菌生理鹽水沖洗并刮取純化菌落表面的菌絲和孢子，將沖洗下來(lái)的生理鹽水和孢子混合液靜置5 min～10 min，取上清液渦旋15 s制成孢子懸液。將孢子懸液用生理鹽水調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝籟6]，懸液濃度為1×106cfu/mL。隨機(jī)選取9 只/組小鼠進(jìn)行試驗(yàn)分組：A組免疫抑制組：分別注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg）、青霉素鈉（15 mg/只），B組非免疫抑制組：注射青霉素鈉（15 mg/只），C 組陰性對(duì)照：注射0.1 mL 生理鹽水）。每組分3 種接種途徑（皮膚涂擦為A1、B1 和C1 組；皮下注射A2、B2 和C2 組；腹腔接種A3、B3和C3組）進(jìn)行接種，每組各3只。

每日觀察小鼠接種處皮膚是否出現(xiàn)皮屑、紅斑、結(jié)痂，毛發(fā)生長(zhǎng)變化并記錄。感染后第10 d 乙醚麻醉后頸椎脫臼迫殺并解剖小鼠，觀察主要臟器病變并取接種處皮膚和脾臟用福爾馬林固定后由武漢賽維爾生物科技有限公司制作切片，HE 染色后經(jīng)顯微鏡觀察病理組織切片并拍照。

1.6 藥敏試驗(yàn) 選用灰黃霉素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑，按照參考文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行分離菌株的藥敏試驗(yàn)，并計(jì)算分離菌對(duì)各藥物的最低抑菌濃度（MIC）。根據(jù)M38-A 標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，對(duì)于酮康唑、氟康唑和灰黃霉素，其MIC 值定義為與對(duì)照組相比出現(xiàn)50% 生長(zhǎng)抑制時(shí)的最低藥物濃度；對(duì)于伊曲康唑MIC 值則定義為與對(duì)照組相比出現(xiàn)完全不生長(zhǎng)時(shí)的最低藥物濃度。試驗(yàn)重復(fù)2 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 將采集的樣品分別接種于含有放線菌酮和氯霉素的SDA 培養(yǎng)基出現(xiàn)表面密絨狀，具同心輪紋的菌落；初為乳白色，隨生長(zhǎng)時(shí)間顏色逐漸變深從淡黃色、棕黃色至黑褐色，中心色比邊緣色更深，邊緣仍呈乳白色（圖1A），背面也呈乳白色至棕黃色至黑褐色過(guò)渡的菌落。將形態(tài)不同的單個(gè)菌落分別接種到新的普通SDA 培養(yǎng)基中于25 ℃培養(yǎng)7 d，用銅圈培養(yǎng)法觀察菌絲和孢子形態(tài)，將其經(jīng)棉蘭染色后于顯微鏡下觀察到菌絲和孢子。結(jié)果可見(jiàn)有隔菌絲直立而偶分支；孢子呈倒棒形，0～2個(gè)縱或斜隔膜，喙及假喙柱狀（圖1B）。其在25 ℃SDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。以上特征與鏈格孢屬真菌孢子相似。結(jié)合臨床癥狀，初步診斷該批肉?；颊婢云つw病，但真菌種類(lèi)太多，從顯微鏡下僅觀察到真菌孢子，不能作為最終鑒定或診斷的依據(jù)。從多份病灶樣品中分離到菌落和孢子形態(tài)相似的數(shù)株真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和ITS 結(jié)果綜合分析，最終確認(rèn)為均是同1株真菌，將其命名為PY2-1-2。本實(shí)驗(yàn)中在培養(yǎng)基中加入放線菌酮主要是抑制腐生真菌和環(huán)境中的雜菌，人醫(yī)通常認(rèn)為加放線菌酮仍能生長(zhǎng)的真菌幾乎均具有致病性。其菌落及孢子形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)鏈格孢屬真菌相似，疑似病牛皮膚病為鏈格孢屬真菌感染。

圖1 分離菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the isolate

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 經(jīng)PCR 擴(kuò)增分離菌株的ITS 基因獲得543 bp 目的基因片段。提交序列至GenBank 獲得序列號(hào)為MH656780.1。利用BLAST 與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該基因序列進(jìn)行比對(duì)，該菌株與細(xì)極鏈格孢菌（MG975630.1）的相似性為99%。采用最大簡(jiǎn)約法經(jīng)過(guò)1 000 次自展分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，顯示兩者以95%支持率聚在同一分支（圖2）。表明該菌為細(xì)極鏈格孢菌。

真菌核糖體RNA 基因（rDNA）有廣泛的保守區(qū)和可變區(qū)，可選用一個(gè)或幾個(gè)合適保守區(qū)基因片段進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定，而ITS 基因序列在不同種屬真菌間可變性很大，可鑒定其屬、種水平[7]，因而ITS 基因序列分析是真菌分子生物學(xué)鑒定的可靠方法，廣泛應(yīng)用于致病菌的鑒定和分型[8]，且相似性超過(guò)98%的菌株可認(rèn)定為同一菌種。本研究在初步診斷病因后，鑒于ITS 基因序列分析在鏈格孢屬真菌的分類(lèi)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究中被證明是一種快速有效的方法[9]，所以采用真菌通用引物ITS1、ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果利用BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果與表型鑒定結(jié)果相吻合。構(gòu)建分離菌株的ITS 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后顯示分離株P(guān)Y2-1-2 與A. tenuissima 聚為同一支，置信度檢測(cè)結(jié)果為99%，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)和BLAT 比對(duì)結(jié)果將PY2-1-2 菌株鑒定為A.tenuissima，確診病牛皮膚病為細(xì)極鏈格孢菌感染的真菌病。

圖2 分離菌株的ITS 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of the isolate

2.3 小鼠致病性試驗(yàn) 將菌懸液通過(guò)皮膚涂擦、皮下注射和腹腔注射方式接種小鼠，同時(shí)設(shè)免疫抑制組和非免疫抑制組和陰性對(duì)照組，也經(jīng)同樣的方式接種小鼠。結(jié)果顯示，免疫抑制皮下接種組的小鼠出現(xiàn)炎性肉芽腫，接種處出現(xiàn)皮屑與脫毛癥狀，與相關(guān)報(bào)道[10]癥狀一致；免疫抑制皮膚涂擦組相較于非免疫抑制涂擦組的皮膚痊愈速度較慢，可能是因免疫抑制使小鼠對(duì)該菌的感染程度更嚴(yán)重，使得機(jī)體需一定時(shí)間抵御異物感染；腹腔注射組小鼠無(wú)論是免疫抑制組還是非免疫抑制組均未出現(xiàn)臨床癥狀，僅免疫抑制腹腔注射組中1 只小鼠腹腔腹膜出現(xiàn)橙色小顆粒，可能是個(gè)體差異導(dǎo)致。陰性對(duì)照組無(wú)明顯癥狀。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)極鏈格孢菌可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)脫毛和皮屑等皮膚病癥狀，與肉牛的臨床表現(xiàn)類(lèi)似。

剖檢后，可見(jiàn)免疫抑制皮下組小鼠和非免疫抑制皮下組小鼠皮下均有結(jié)節(jié)膿腫，觸摸質(zhì)地較硬。免疫抑制皮下和腹腔注射組小鼠脾臟均出現(xiàn)不同程度腫大。陰性對(duì)照組無(wú)明顯剖檢變化。免疫抑制皮下組皮膚組織病理變化主要為感染性肉芽腫，病變處有細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，皮膚表皮層明顯增厚；脾臟紅細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。表明，該菌對(duì)小鼠有感染性并且產(chǎn)生相應(yīng)的皮膚感染癥狀。有研究顯示僅有5%的鏈格孢屬菌感染人和動(dòng)物，但大多數(shù)為其屬中的鏈格孢霉[11]和侵染鏈格孢[3]，少有報(bào)道細(xì)極鏈格孢菌感染動(dòng)物可以引起其患皮膚病。鏈格孢屬真菌大量繁殖菌絲導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病，引起的病理變化普遍為膿腫和慢性炎癥肉芽腫。

2.4 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：該菌對(duì)灰黃霉素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑的MIC值分別為0.5 μg/mL、4 μg/mL、1 μg/mL、1 μg/mL，該菌對(duì)酮康唑、氟康唑、伊曲康唑和灰黃霉素均敏感，其中灰黃霉素抑菌效果最好。

圖3 小鼠皮膚及脾臟病理組織變化Fig.3 The mouse skin and spleen of pathological changes

目前，因美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）針對(duì)絲狀真菌的微量液基稀釋法（M38-A2 方案）具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性而獲得廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。趙禹皓實(shí)驗(yàn)表明鏈格孢屬各菌株對(duì)兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑和制霉菌素均敏感[11]；也有研究稱鏈格孢屬菌對(duì)5-氟胞嘧啶敏感度最高，且大多數(shù)常見(jiàn)真菌均對(duì)其敏感[1]。臨床上對(duì)細(xì)極鏈格孢菌的藥物敏感性研究十分有限，不同種的鏈格孢屬菌對(duì)藥物的敏感性存在一定差異，且相同種屬的不同菌株的藥物敏感性也存在一定差異，因此有必要對(duì)不同菌株的體外藥物敏感性進(jìn)行試驗(yàn)后再參考用藥，對(duì)臨床選擇合適抗真菌藥物治療真菌感染有重要意義。

本研究將豐富肉牛真菌性皮膚病的病原學(xué)，為診斷和治療本病提供參考。