重組揚州鵝IFN-α的表達與活性研究

朱孟玲，王 岑，曹 霞，徐孝宙，劉海俠，王會聰，王永娟

（1. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300；4. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

揚州白鵝，又稱揚州鵝，是我國首次利用國內(nèi)鵝種資源育成的揚泰地方品種，被譽為我國第一個新鵝種，是理想的中型鵝種。但是，其飼養(yǎng)過程常受多種傳染性疾病影響，特別是如小鵝瘟、鵝禽流感、鵝法氏囊病、鵝副粘病毒病等病毒性傳染病威脅著鵝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。目前，防制病毒性疾病的有效方法主要有疫苗免疫、天然抗病毒藥物應(yīng)用等。干擾素作為一類重要的細(xì)胞因子，具有廣譜的抗病毒活性、良好的抗腫瘤活性以及高效的免疫調(diào)節(jié)等功能[2-3]。自1986 年Lefevre 等首次克隆了豬干擾素以來[4]，干擾素已從之前的單一成分發(fā)展為多成分、多功能制劑，廣泛應(yīng)用于不同畜禽傳染病，如新城疫、禽流感、雞傳染性法氏囊病等病毒性疾病的預(yù)防與治療[5]。重組揚州鵝干擾素與其它干擾素一樣，具有廣譜、高效、安全等優(yōu)點，是鵝傳染病防治中一種重要途徑。在雞、鴨等家禽類的干擾素藥物已經(jīng)投入防病治病的今天，鵝干擾素在世界范圍內(nèi)的研究卻只處于起步階段[6-7]，相關(guān)的研究報道較少，因此鵝干擾素的研究尤為迫切。

本研究分別通過原核和真核表達系統(tǒng)制備重組揚州鵝干擾素，將原核表達產(chǎn)物免疫小鼠后獲得高效價抗體，填補了尚無鵝干擾素抗體的空缺；同時，為深入研究揚州鵝干擾素的分子生物學(xué)特性和抗病毒作用機理以及研制鵝病毒性疾病的新型制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物 載體pET-32a（+）、載體pcDNA3.1（-）、工程菌E.coli DH5α菌株、E.coli BL21（DE3）菌株由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存；水泡性口炎病毒（VSV）由揚州大學(xué)成大榮教授惠贈；鵝胚和成年揚州鵝由江蘇畜禽遺傳資源研究所提供；4 周齡雌性BALB/c 小鼠購自揚州大學(xué)動物醫(yī)學(xué)比較中心。

1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、Taq DNA 聚合酶、1 kb DNA Ladderr 購自Fermentas 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自愛思進公司；SDS-PAGE 電泳試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG-FITC、DAB 顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；5×SDS-PAGE Loading Buffer、96孔酶標(biāo)板購自生工生物工程（上海）有限公司；ELISA 顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司；Triton X-100 購自上海江萊生物科技有限公司；中性紅指示劑購自上海研臣實業(yè)有限公司。

1.3 揚州鵝IFN-α全長基因和成熟肽基因的擴增根據(jù)GenBank 中鵝α-干擾素（GoIFN-α）基因序列（HQ115583）設(shè)計擴增GoIFN-α基因全長序列的引物（F1:5'-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3'/R1:5'-TTA GCGCATGGCGCGGGTGAGG-3'），以及擴增成熟肽基因的引物（F2: 5'-AAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3'/R2:5'-GCAAGCTTTTAGCGCATGGCGCGGG TGA-3'），引物由上海英濰捷基公司合成。

采鵝翼靜脈抗凝血，按照淋巴細(xì)胞分離液說明書分離淋巴細(xì)胞，按照TRIzol 說明書提取淋巴細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板， 分別以F1/R1、F2/R2 進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 GoINF-α全長基因和成熟肽基因的克隆與鑒定 將純化回收的揚州鵝IFN-α 成熟肽基因與pET32a（+）連接，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coli DH5α受體菌， 增菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Hind III酶切鑒定，陽性產(chǎn)物命名為pET-mGoIFN-α。

將回收的揚州鵝IFN-α 全長基因克隆于pcDNA3.1（-）載體，重組質(zhì)粒命名為pcDNA-GoIFN-α，經(jīng)Xho I 酶切鑒定后陽性重組質(zhì)粒由上海英濰捷基公司測序鑒定。

1.5 高免血清制備 常規(guī)方法誘導(dǎo)pET-mGoIFN-α/BL21。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 檢測，1 mol/L KCL 染色，切下預(yù)期大小的蛋白條帶液氮研磨，BCA 法測其濃度。按100 μg/只重組蛋白頸背部皮下注射免疫5 只BALB/c 小鼠，每10 d 免疫一次，4 免后第3 d 再加強免疫，眼眶靜脈采血，分離血清，備檢。

1.6 抗體效價與特異性檢測 以純化后的mGoIFN-α作為抗原， 羊抗鼠IgG-HRP（1∶100 000）作為二抗，ELISA 法測定血清中揚州鵝IFN-α成熟肽抗體效價。設(shè)置未免疫小鼠血清為陰性對照。同時，以純化的mGoIFN-α為抗原，收集的免疫小鼠血清作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，western blot 檢測和分析抗體特異性。

1.7 GoIFN-α抗病毒活性檢測 參考脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將制備的無內(nèi)毒素的pcDNA-GoIFN-α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染自制的鵝胚成纖維細(xì)胞（GEF），以自制的抗mGoIFN-α抗體為一抗，羊抗鼠IgG-FITC（1∶10 000）為二抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）檢測GoIFN-α重組蛋白（rGoIFN-α）表達情況。確定表達后將其大量轉(zhuǎn)染DEF，收集細(xì)胞及上清，凍融后離心收集上清，并用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液10 倍比稀釋（100～10-10），保存?zhèn)溆谩?/p>

在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)GEF，待單層細(xì)胞長至約90%時接入倍比稀釋的rGoIFN-α，繼續(xù)37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h 后每孔接入100 TCID50VSV。同時設(shè)空白對照組（僅GEF）和病毒對照組（僅VSV）[8-10]，每隔12 h 觀察一次。當(dāng)發(fā)現(xiàn)病毒對照組75%出現(xiàn)病變時，用含中性紅染液的DMEM 染色，酸性乙醇脫色，測定OD550nm值。以能夠保護50%的GEF 細(xì)胞免受VSV 攻擊的稀釋度為一個活性單位（U），確定蛋白的抗病毒活性。

2 結(jié) 果

2.1 GoINF-α基因擴增鑒定 利用RT-PCR 法擴增GoIFN-α成熟肽基因和IFN-α全長基因，分別獲得486 bp 和576 bp 的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1），且測序結(jié)果正確，表明擴增得到目的基因。

2.2 重組質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pET-mGoIFN-α 經(jīng)BamH I 與Hind III 雙酶切后，在約500 bp 和5 900 bp處可見目的條帶（圖2）；重組質(zhì)粒pcDNA-GoIFN-α用Xho I 酶切后檢測，在約400 bp 與5 500 bp 處可見目的條帶（圖3）；均與預(yù)期相符，表明重組表達質(zhì)粒正確構(gòu)建。

2.3 重組蛋白表達鑒定 pET-mGoIFN-α/BL21 經(jīng)誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE 鑒定， 結(jié)果顯示： 在36.3 ku處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，與預(yù)期大小相符（圖4），表明重組蛋白以包涵體的形式存在且表達量較大。

圖1 PCR 擴增產(chǎn)物鑒定Fig.1 The identification of PCR amplicons

圖2 pET-mGoIFN-α的酶切鑒定Fig.2 Restriction analysis of pET-mGoIFN-α

圖3 pcDNA-GoIFN-α 的酶切鑒定Fig.3 Digestion analysis of pcDNA-GoIFN-α

圖4 mGoIFN-α的表達Fig.4 Expression of mGoIFN-α

2.4 抗體效價與特異性檢測 ELISA 檢測結(jié)果顯示免疫鼠抗mGoINF-α 制備的抗體效價為1∶16 000。Western blot 分析結(jié)果顯示，在目的蛋白對應(yīng)位置36.3 ku 處出現(xiàn)特異性顯色（圖5）。表明免疫鼠抗體具有較強的特異性。

圖5 鼠抗血清western blot 檢測Fig.5 Reactivity analysis of immune serum in mice by western blot

2.5 rGoIFN-α 在GEF 中 的 表 達 檢 測 pcDNAGoIFN-α轉(zhuǎn)染GEF 48 h 后，IFA 檢測rGoIFN-α的表達情況，結(jié)果顯示，pcDNA-GoIFN-α轉(zhuǎn)染的GEF 中出現(xiàn)熒光，且細(xì)胞核周圍熒光亮度最強，而空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的GEF中無熒光（圖6）。表明rGoIFN-α在GEF 中得到表達。

圖6 rGoINF-α表達的IFA 鑒定Fig.6 Indirect immunofluorescence analysis for pcNDA-GoIFN-α expression

2.6 rGoIFN-α抗VSV 活性檢測 采用細(xì)胞病變抑制法，在GEF-VSV 系統(tǒng)中檢測rGoIFN-α的抗病毒活性。接毒后約36 h，經(jīng)顯微鏡觀察：正常生長的GEF 未出現(xiàn)病變（圖7A）； 加入不同稀釋度rGoIFN-α的細(xì)胞均發(fā)生了輕微病變，稀釋倍數(shù)越低GEF 病變越弱，甚至有些未出現(xiàn)病變；稀釋倍數(shù)越高GEF 皺縮狀態(tài)越嚴(yán)重，與只加入病毒的陽性對照組相比，細(xì)胞殘缺程度明顯較輕（圖7B）；VSV 陽性對照組GEF 嚴(yán)重皺縮，病變程度高（圖7C）。

圖7 抗病毒活性鑒定Fig.7 Antiviral activity analysis

計算真核表達的rGoIFN-α抗VSV 活性約為1.20×105U/mL，比 活 性 為3.84×104U/mg（n=3）。表 明rGoIFN-α能夠保護GEF 免受VSV 攻擊，具有較高的抗VSV 活性。

3 討 論

表達外源蛋白主要采用植物表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)等。原核表達系統(tǒng)具有生物結(jié)構(gòu)簡單、生長周期短、遺傳穩(wěn)定、價格低廉、操作簡便、菌體密度高、便于快速大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點[11]，同時原核表達系統(tǒng)從誘導(dǎo)直至表達的整個過程均相對易控，是多數(shù)蛋白表達科研工作者的首選系統(tǒng)。本研究選用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)進行表達，主要是基于大腸桿菌可以快速表達外源蛋白以制備免疫原的優(yōu)點，能在短時間內(nèi)獲得可用于動物免疫的純化蛋白，進而獲得特異性抗血清。但是原核表達產(chǎn)物常以包涵體的形式存在，包涵體的純化、變性、復(fù)性操作繁瑣[12]，且蛋白容易失去活性，所以本研究又選擇了能對外源蛋白進行加工修飾的真核表達系統(tǒng)，以確保所表達的重組INF 接近天然狀態(tài)，具有較好的活性[13-14]。以自制的抗rGoIFN-α抗體為一抗，IFA 檢測真核表達產(chǎn)物，結(jié)果顯示，rIFN-α能在GEF 中表達，在細(xì)胞核周圍的熒光尤為明顯，從細(xì)胞核向胞漿發(fā)散。但是多次重復(fù)實驗后發(fā)現(xiàn)，在相同的轉(zhuǎn)染時間后，每個細(xì)胞的熒光亮度不盡相同，推測這可能與GEF 自身的形態(tài)大小與其攝入目的基因的片段量的多少有關(guān)。

本研究將原核表達的mGoIFN-α經(jīng)SDS-PAGE 電泳切膠后的產(chǎn)物作為抗原，用液氮對凝膠進行輔助研磨，直接注射入小鼠體內(nèi)，并沒有額外加入免疫佐劑，卻獲得了效價較高的特異性抗體，這可能是跟凝膠本身也可作為一種特殊的佐劑發(fā)揮緩釋功能有關(guān)[15-16]。另外，采用切膠回收制備免疫原，制備方法簡單、回收量大、產(chǎn)物純度高、具有佐劑活性、成本低廉，可以克服常規(guī)過柱純化方法的一些缺點。

與其它禽類IFN 相比，GoIFN-α 研究起步較慢，在世界范圍內(nèi)的研究只處于剛剛起步階段。本研究主要圍繞抗病毒功能較強的揚州GoIFN-α分別做原核表達和真核表達，制備的高效價抗體解決了目前沒有抗GoIFN-α抗體的問題，也為真核表達時的IFA 檢測提供了必須的生物材料；真核表達的重組揚州鵝IFN-α具有較好的抗病毒活性，為進一步開展揚州鵝IFN 的分子生物學(xué)特性和抗病毒作用機理、研制防治鵝病毒性疾病的新型制劑奠定了基礎(chǔ)。