牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的制備及阻斷ELISA 方法的建立

向文杰，李德棟，林 俊，陳瑞紅，楊木嬌，薛 飛，朱遠(yuǎn)茂

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

牛傳染性鼻氣管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原，感染后主要表現(xiàn)流涕、流淚、咳嗽、呼吸困難和體溫升高等臨床癥狀。IBRV 感染除引起呼吸道炎癥外，還可引起結(jié)膜炎、乳房炎、膿皰性外陰陰道炎或龜頭包皮炎、犢牛腦膜腦炎和流產(chǎn)等[1]。此外，IBRV 還可引起機(jī)體免疫抑制，進(jìn)而繼發(fā)細(xì)菌或支原體感染，導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）[2]，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)該疫病的防控措施主要有兩種：一是在該病的低發(fā)區(qū)淘汰檢測(cè)出的陽(yáng)性動(dòng)物；二是在該病的高發(fā)區(qū)接種相關(guān)的gE 基因缺失疫苗，并淘汰gE 抗體陽(yáng)性動(dòng)物。歐洲已經(jīng)啟動(dòng)了IBR 的根除計(jì)劃，奧地利、丹麥、芬蘭、瑞典、瑞士等已根除了IBR[3-5]。我國(guó)牛群IBRV 血清陽(yáng)性率約46%，時(shí)有IBRV 局部流行，目前對(duì)該病的血清學(xué)診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室的中和試驗(yàn)或ELISA，尚無(wú)自主研發(fā)的商品化IBRV 血清抗體檢測(cè)試劑盒[6]，因此有必要開展相關(guān)診斷技術(shù)的研究。

本研究以經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化的IBRV 全病毒作為免疫原，制備1 株IBRV 特異性單克隆抗體（MAb），再以該MAb 作為檢測(cè)抗體建立檢測(cè)牛血清抗體的阻斷ELISA 方法。該方法具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可以應(yīng)用于IBRV 疫苗免疫監(jiān)測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查。IBRV 特異性MAb 的獲得為IBRV 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定一定的基礎(chǔ)，阻斷ELISA 方法的建立為我國(guó)IBR 的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 IBRV Barthanu/67、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛副流感病毒3 型（BPIV3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。牛腎細(xì)胞（MDBK）和SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，6 周齡～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 聚乙二醇（PEG）、HT、HAT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、DMEM 均購(gòu)自Sigma 公司；明膠購(gòu)自FlakaAG 公司；脫脂乳購(gòu)自博士德生物工程有限公司；馬血清購(gòu)自Hy-Clone 公司；3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自北京泰天河生物技術(shù)有限公司；可拆卸ELISA 酶標(biāo)板購(gòu)自Costar 公司。

1.3 血 清 IBRV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；IBRV 滅活疫苗免疫牛血清采自內(nèi)蒙某一肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)；IBRV 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清采自黑龍江省某散養(yǎng)戶牛；BVDV、BPIV3 和BADV-3 陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；O 型FMDV 陽(yáng)性血清為疫苗免疫血清（周國(guó)輝副研究員惠贈(zèng)）；血清樣本采自內(nèi)蒙古、黑龍江、江蘇、吉林、山西、北京、廣東等?。ㄊ?、自治區(qū)）（辛九慶研究員惠贈(zèng)）。

1.4 全病毒抗原的制備 將1000 TCID50IBRV 接種于已長(zhǎng)成良好單層的MDBK 細(xì)胞，CPE 達(dá)80%以上收毒。病毒液經(jīng)30%和60%的蔗糖密度梯度超速離心（100 000 g，4 ℃，3 h） 純化，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)SDS-PAGE 電泳觀察純化效果，并用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。

1.5 MAb 的制備 取純化的IBRV，經(jīng)滅活乳化后免疫6 周齡～8 周齡的BALB/c 雌性小鼠。取小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞融合，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA 進(jìn)行MAb 篩選，對(duì)獲得的MAb 制備小鼠腹水。

1.6 MAb 的鑒定

1.6.1 間接免疫熒光（IFA）鑒定 待IBRV 接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長(zhǎng)成良好單層的MDBK 細(xì)胞，CPE達(dá)到80%左右時(shí)用-20 ℃預(yù)冷乙醇固定，然后加入MAb 腹水（1∶1 000），4 ℃作用過(guò)夜，加入山羊抗鼠IgG-FITC（1∶64），37 ℃避光孵育1 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)BVDV、BPIV3 和正常MDBK細(xì)胞對(duì)照。

1.6.2 Western blot 鑒定 純化的IBRV 進(jìn)行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂乳4 ℃封閉過(guò)夜后加入MAb 腹水（1∶1 000），37 ℃作用1 h，加入Dylight 800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000），37 ℃避光孵育1 h 后于掃膜儀觀察結(jié)果。1.6.3 質(zhì)譜鑒定 根據(jù)1.6.2 試驗(yàn)結(jié)果，切取與MAb反應(yīng)相對(duì)應(yīng)的IBRV SDS-PAGE 電泳條帶，由上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.7 阻斷ELISA 方法的建立及初步應(yīng)用

1.7.1 最佳工作條件的確定 采用方陣滴定法確定全病毒IBRV 最佳包被濃度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200 和1∶1 400，抗原蛋白濃度為5.35 mg/mL）和檢測(cè)MAb cp-1-1 最佳稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3 200、 1∶6 400 和1∶12 800， MAb 濃 度 為

7.8 mg/mL），待檢血清（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 和1∶32）和山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000、1∶10 000 和1∶20 000）最佳稀釋度最佳封閉液（1%明膠、2%明膠、3%明膠、5%脫脂乳、10%馬血清和20%馬血清），最佳封閉時(shí)間（1 h、2 h 和4 h），血清（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、MAb cp-1-1（0.5 h、1 h 和2 h）、羊抗鼠IgG-HRP（0.5 h、1 h 和1.5 h）和TMB（5 min、10 min 和15 min）的最佳作用時(shí)間。

1.7.2 臨界值的確定 取實(shí)驗(yàn)室保存的50 份IBRV抗體呈弱陽(yáng)性的牛血清（中和抗體效價(jià)為1∶4～1∶16），同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性牛血清作為陰性對(duì)照，按照1.7.1 確定的阻斷ELISA 操作程序進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD450nm值。規(guī)定以上述50 份弱陽(yáng)性牛血清的平均OD450nm值加2 倍的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）作為該方法的OD450nm臨界值，按照如下公式計(jì)算抑制率臨界值。

1.7.3 特異性試驗(yàn) 按照已建立的阻斷ELISA 方法對(duì)IBRV、BVDV、BPIV3、BADV-3 和O 型FMDV 陽(yáng)性牛血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)抑制率臨界值判斷該方法的特異性。

1.7.4 敏感性試驗(yàn) 選擇中和抗體效價(jià)為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 共10 份血清，對(duì)上述血清2 倍倍比稀釋，每份血清最高稀釋至比中和抗體效價(jià)高2 個(gè)滴度，例如中和效價(jià)為1∶4，則血清稀釋至1∶16。用本研究建立的阻斷ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的敏感性。

1.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次包被的ELISA 板，用IBRV 陰、陽(yáng)性牛血清各3 份進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；取不同批次包被的ELISA 板，用IBRV 陰、陽(yáng)性牛血清各3 份進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.7.6 符合率試驗(yàn) 取130 份現(xiàn)地牛血清，分別用中和試驗(yàn)和本研究建立的阻斷ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算該方法與中和試驗(yàn)的符合率。

1.7.7 阻斷ELISA 方法的初步應(yīng)用

1.7.7.1 用于免疫監(jiān)測(cè) 內(nèi)蒙古某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)施了IBRV 滅活疫苗免疫，免疫后2 個(gè)月，采集206 份牛血清，采用本研究建立的阻斷ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估疫苗免疫后抗體產(chǎn)生情況。

1.7.7.2 用于IBRV 血清抗體流行病學(xué)調(diào)查 收集我國(guó)10 個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）牛血清共801 份，采用本研究建立的阻斷ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，以調(diào)查我國(guó)IBRV 血清陽(yáng)性率的情況。

2 結(jié) 果

2.1 全病毒抗原純化結(jié)果 利用MDBK 細(xì)胞擴(kuò)增的IBRV 經(jīng)30%和60%蔗糖密度梯度超速離心后在60%層面上有一白色的病毒帶，吸取脫糖后經(jīng)SDSPAGE 電泳。結(jié)果顯示，純化的病毒與未純化的病毒相比，培養(yǎng)液中的血清蛋白均去除，可見(jiàn)病毒的各結(jié)構(gòu)蛋白，純化效果良好（圖略）。純化后經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm為1.06，蛋白含量為5.35 mg/mL。

2.2 MAb 的篩選 經(jīng)間接ELISA 篩選獲得1 株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，OD450nm值為1.95，命名為cp-1-1。經(jīng)3次有限稀釋法克隆純化后陽(yáng)性率為100%。

2.3 MAb 的鑒定 IFA 結(jié)果顯示，MAb cp-1-1 與IBRV 呈陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)特異性綠色熒光，而與BVDV、BPIV3 和正常MDBK 細(xì)胞均不反應(yīng)（圖1）。表明MAb 具有較強(qiáng)的特異性。

圖1 MAb cp-1-1 的IFA 鑒定Fig.1 Identification of MAb cp-1-1 with IBRV,BVDV,BPIV3 and MDBK by IFA

Western blot 結(jié) 果 顯 示，MAb 與 純 化 的IBRV 在約100 ku 位置呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)特異性條帶（圖2）。表明，該MAb 可能為針對(duì)IBRV VP8 蛋白。

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，切取與MAb 呈western blot陽(yáng)性反應(yīng)相對(duì)應(yīng)的IBRV SDS-PAGE 電泳條帶，由上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示該蛋白為IBRV 的VP8 被膜蛋白（圖略）。

2.4 阻斷ELISA 方法的建立及初步應(yīng)用

2.4.1 最佳反應(yīng)條件的確定 根據(jù)方陣滴定及優(yōu)化后的各反應(yīng)條件，確定阻斷ELISA 方法最優(yōu)條件如下（表1）。

圖2 MAb 與IBRV 反應(yīng)的western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of the reaction of the MAb cp-1-1 against IBRV

表1 阻斷ELISA 檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized of reaction conditions for blocking ELISA assay

2.4.2 臨界值的確定 50 份IBRV 中和抗體呈弱陽(yáng)性的牛血清按照確定的阻斷ELISA 操作程序進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其平均OD450nm為0.34（圖3），標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.045，根據(jù)平均OD450nm值加2 倍的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）計(jì)算，OD450nm臨界值為0.43。標(biāo)準(zhǔn)陰性牛血清的平均OD450nm值為0.897。按照臨界值計(jì)算公式得出該方法的抑制率臨界值為52.06%，即當(dāng)抑制率≥52.06%時(shí)，判定結(jié)果為陽(yáng)性，當(dāng)抑制率＜52.06%時(shí)，判定結(jié)果為陰性。

圖3 50 份弱陽(yáng)性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.3 50 weak positive samples normal distribution diagram

2.4.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的阻斷ELISA 方法對(duì)IBRV、BVDV、BPIV3、BADV3 和O-FMDV 陽(yáng)性牛血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示僅IBRV 陽(yáng)性牛血清抑制率達(dá)80%以上；其余均低于10%（圖4），表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)中和抗體效價(jià)為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 共10 份血清，分別標(biāo)記為1～10 號(hào)。利用本研究建立的方法進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，結(jié)果顯示該方法可檢測(cè)的最低中和抗體效價(jià)為1∶4，即中和抗體效價(jià)在1∶4 及以上時(shí)，該方法檢測(cè)呈陽(yáng)性。9號(hào)血清中和抗體效價(jià)為1∶512，采用該ELISA 方法檢測(cè)的效價(jià)為1∶1 024，其它8 份血清中和抗體效價(jià)與該方法檢測(cè)效價(jià)一致（表2），表明該方法與中和試驗(yàn)敏感性基本一致，中和抗體效價(jià)不低于1∶4 可檢測(cè)為陽(yáng)性。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，6 份血清的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)及批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均在10%以內(nèi)（表3），表明該方法具有良好的可重復(fù)性。2.4.6 符合率試驗(yàn)結(jié)果 130 份現(xiàn)地牛血清，采用中和試驗(yàn)和本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示中和試驗(yàn)檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品數(shù)為75，呈陰性的樣品數(shù)為55；本研究建立的方法檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品數(shù)為77，呈陰性的樣品數(shù)為53。通過(guò)計(jì)算，該方法與中和試驗(yàn)的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為96.36%，總體符合率為98.46%（表4）。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specific test results

表2 阻斷ELISA 方法與中和試驗(yàn)檢測(cè)效價(jià)的比較Table 2 Comparison of the titer with the blocking ELISA method and neutralization test

表3 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeated test results

2.4.7 阻斷ELISA 方法的應(yīng)用

2.4.7.1 免疫監(jiān)測(cè) 對(duì)內(nèi)蒙古某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)施了IBRV 滅活疫苗免疫的牛血清206 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示205 份呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)99.51%（205/206），表明疫苗免疫后誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生良好。

表4 符合率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Conformity test results

2.4.7.2 血清流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)我國(guó)8 個(gè)省（市、自治區(qū)）共801 份牛血清，利用本研究建立的ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示IBRV 抗體陽(yáng)性率為0～86.89% ，總體陽(yáng)性率為41.6%（333/801）（表5），表明我國(guó)IBRV 血清陽(yáng)性率處于較高水平，應(yīng)引起重視。

表5 血清流行病學(xué)調(diào)查Table 5 Serum epidemiological survey

3 討 論

IBRV 是皰疹病毒科的成員，能夠引起牛傳染性鼻氣管炎，感染牛容易繼發(fā)細(xì)菌感染。該病毒可引起潛伏感染，導(dǎo)致乳汁減少、體重下降、流產(chǎn)甚至死亡[7]，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)IBRV 血清陽(yáng)性率達(dá)46.03%（3933/8545），表明在我國(guó)存在嚴(yán)重的IBRV 感染。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化IBRV 的診斷試劑，國(guó)外的檢測(cè)試劑盒比較昂貴，因此有必要進(jìn)行IBRV 相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的研究。

本研究曾嘗試用環(huán)磷酰胺免疫抑制法篩選針對(duì)IBRV gE 蛋白的特異性MAb。先用IBRV gE 缺失株和環(huán)磷酰胺同時(shí)免疫小鼠，小鼠對(duì)IBRV 除gE 蛋白之外的其它蛋白產(chǎn)生免疫抑制，再用全病毒對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫，以期篩選到針對(duì)IBRV gE 蛋白的特異性MAb。但可能由于環(huán)磷酰胺抑制強(qiáng)度或抑制時(shí)間不足，也可能由于VP8 蛋白是IBRV 含量最豐富的被膜蛋白，其未得到完全的免疫抑制，再者VP8 蛋白部分暴露在病毒粒子表面，造成本研究只篩選到針對(duì)IBRV VP8 蛋白的MAb，未獲得針對(duì)gE 蛋白的MAb。

目前我國(guó)用于IBRV 抗體檢測(cè)方法主要有中和試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室自建的間接ELISA 和進(jìn)口的競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法，國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的抗體檢測(cè)試劑。本研究利用IBRV VP8 MAb 建立了檢測(cè)牛血清抗體的阻斷ELISA方法。VP8 蛋白為IBRV 中含量最高的被膜抗原[9]，且為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的整個(gè)復(fù)制周期中一直存在，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的抗體[10]，所以用針對(duì)該蛋白的MAb 建立的阻斷ELISA 方法來(lái)檢測(cè)抗體是可行的。IBRV nu/67 株的VP8 蛋白序列與國(guó)內(nèi)其它IBRV 分離株序列一致性為100%，所以本研究建立的ELISA 方法能夠用于國(guó)內(nèi)IBRV 血清學(xué)檢測(cè)。該方法可檢測(cè)到IBRV 滅活疫苗免疫誘導(dǎo)的抗體最早時(shí)間為首次免疫后1 周，表明該阻斷ELISA方法可以用于疫苗免疫后的血清抗體監(jiān)測(cè)，根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果可以快速確定疫苗免疫的效果和血清中的抗體水平，從而制定科學(xué)的免疫程序。此外，該方法可檢測(cè)的最低中和抗體效價(jià)為1∶4，與中和試驗(yàn)的敏感性一致，中和試驗(yàn)檢測(cè)需要5 d～7 d，該方法僅需1 d，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，為疫病的快速診斷和早期防控提供依據(jù)。

為了簡(jiǎn)化ELISA 操作術(shù)式，本研究嘗試用HRP直接標(biāo)記MAb cp-1-1 作為檢測(cè)抗體，但標(biāo)記后進(jìn)行檢測(cè)由于陰性樣品OD450nm值偏低導(dǎo)致阻斷率偏低，不易區(qū)分陰陽(yáng)性，分析其原因可能有三點(diǎn)，第一，MAb經(jīng)標(biāo)記后部分降解或變性，有效MAb含量降低，導(dǎo)致與抗原結(jié)合量減少，使OD450nm值整體偏低，抑制率偏低；第二，MAb標(biāo)記時(shí)可能存在未標(biāo)記的MAb，檢測(cè)時(shí)未標(biāo)記的MAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記的MAb，導(dǎo)致OD450nm值整體偏低，抑制率偏低；第三，HRP與MAb標(biāo)記結(jié)合量少，造成標(biāo)記抗體效價(jià)偏低，同樣導(dǎo)致OD450nm值整體偏低，抑制率偏低。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本研究委托生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行MAb 標(biāo)記，結(jié)果效價(jià)仍然偏低，可能與VP8蛋白本身結(jié)構(gòu)有關(guān)。為此，本研究選擇商品化的山羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗，建立了阻斷ELISA，雖然操作時(shí)多一步程序，但阻斷效果良好，可用于IBRV血清抗體的檢測(cè)。

本研究利用MAb cp-1-1 建立了阻斷ELISA 診斷方法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，與中和實(shí)驗(yàn)的符合率為98.46%，可用于IBRV 免疫監(jiān)測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查，為我國(guó)IBR 的防控奠定了一定的基礎(chǔ)。