豬細(xì)小病毒2 型、3 型、6 型多重PCR 檢測方法的建立及初步應(yīng)用

李 靜，曾 威，朱 玲，何啟蓋

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗，湖北 武漢 430070）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus, PPV）為單鏈DNA 病毒；無囊膜的二十面體結(jié)構(gòu)；其基因組大小約為5 kb～6.3 kb，末端攜帶回文序列是病毒復(fù)制所必須的結(jié)構(gòu)。PPV 是引起初產(chǎn)母豬繁殖障礙的病原之一，感染PPV 臨床表現(xiàn)為產(chǎn)死胎、木乃伊胎，胚胎死亡及不孕癥[1-2]，同時PPV 也被發(fā)現(xiàn)是造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥病原之一[3]。在過去的20 年中，許多新型細(xì)小病毒陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2001 年P(guān)PV2首次在緬甸被發(fā)現(xiàn)[4]；2008 年P(guān)PV3 首次在香港被發(fā)現(xiàn)[5]；2014 年P(guān)PV6 首次在中國被發(fā)現(xiàn)[6]，之后多個國家相繼報道了3 種PPV 流行情況。當(dāng)前上述3 種PPV 檢測方法主要包括血清學(xué)方法、單一PCR 方法、熒光定量PCR 方法，其中血清學(xué)方法存在耗時較長，步驟繁瑣的問題；而單一PCR 與熒光定量PCR 方法均不能發(fā)現(xiàn)是否存在混合感染的情況[7-10]。多重PCR 能同時檢測多種病原，節(jié)省檢測時間與成本?；诖?，本研究擬建立一種多重PCR 方法，為快速鑒定PPV 感染提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株及臨床樣品 本研究所使用的樣品均為湖北省某養(yǎng)殖場送檢的豬流產(chǎn)胎兒（心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)各25 份）。PCV2 WH 株、PEDV YN 株、PRRSV YN 株、PRV 新鄉(xiāng)株、HPS 標(biāo)準(zhǔn)株、APP 標(biāo)準(zhǔn)株均由本實驗室保存。JEV、PPV2、PPV3、PPV6 陽性核酸由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TIANamp Genomic DNA Kit、TIANamp Bacteria DNA Kit均購自北京天根生化科技有限公司；Vira-DNA Kit 購自美國OMEGA 公司；Simply P總RNA 提取試劑盒購自Bio Flux 公司；Biomiga Gel/PCR Extraction Kit 購自美國Biomiga 公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑5×PrimeScript RT Master Mix 購自TaKaRa 公司。

1.3 引物設(shè)計 分別根據(jù)Genbank 中登錄的PPV2（KP765690.1）、PPV3（KY586145.1）、PPV6（KY094494.1）的NS 基因序列保守區(qū)，利用primer5.0 分別設(shè)計3 種PPV 的特異性引物（表1），引物由北京擎科生物公司合成。

1.4 核酸提取 利用DNA 提取試劑盒分別提取PCV2、PRV、HPS、APP 等病原DNA；利用RNA 提取試劑盒分別提取PEDV、PRRSV 等病原RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。提取的核酸利用Nano drop2000 測定相應(yīng)濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 多重PCR 引物序列Table 1 Primers used in the multiplex PCR

1.5 重組質(zhì)粒構(gòu)建 分別以PPV2、PPV3、PPV6 核酸為模板，利用表1 中相應(yīng)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA 5 μL，無菌水16 μL。反 應(yīng) 程 序：95 ℃5 min，95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)，72 ℃7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，利用DNA 純化回收試劑盒回收各單一PCR 目的片段，分別克隆至pMD18-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，經(jīng)PCR 鑒定陽性克隆由北京擎科生物公司測序。提取3 種重組質(zhì)粒，根據(jù)公式：陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝/μL）=（質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023）/（660 道爾頓/堿基×堿基數(shù)），分別計算3 種重組質(zhì)?？截悢?shù)。

1.6 多重PCR 反應(yīng)條件及體系優(yōu)化 將PPV2、PPV3、PPV6 重組質(zhì)粒分別稀釋至4.32×105拷貝/μL、9.62×105拷 貝/μL、4.25×105拷 貝/μL 并 等 體 積 混合，作為多重PCR 反應(yīng)模板。參考單一PCR 反應(yīng)條件，采用方正法分別對引物濃度（0.2 μmol/L～1.0 μmol/L），退火溫度（54 ℃～56 ℃），循環(huán)數(shù)（28～35 個循環(huán)）進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)結(jié)果確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

1.7 特異性試驗 采用建立的多重PCR 方法，分別以3 種PPV 基因組DNA 的混合物和其它病原的DNA（PPV2、 PPV3、 PPV6、 PCV2、 PRV、 HPS、APP）或cDNA（JEV 、PEDV、PRRSV）為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，評價該方法特異性。

1.8 敏感性試驗 將重組質(zhì)粒10 倍倍比稀釋，將稀釋倍數(shù)相同的pMD18-PPV2（4.32×109拷貝/μL～4.32×101拷貝/μL）、pMD18-PPV3（9.62×109拷貝/μL～9.62×101拷貝/μL）、pMD18-PPV6（4.25×109拷貝/μL～4.25×101拷貝/μL）等量混勻作為模板，利用建立的多重PCR 和文獻(xiàn)已報道的單一PCR 方法[8,10]進(jìn)行擴(kuò)增。評價該方法的敏感性。

1.9 臨床樣品檢測 同一豬流產(chǎn)胎兒的組織器官混樣處理視為一份樣品，將25 份樣品反復(fù)融凍3 次離心取上清，使用TIANamp Genomic DNA Kit 提取DNA，應(yīng)用建立的多重PCR 方法進(jìn)行3 次重復(fù)性檢測，并用文獻(xiàn)已報道的單一PCR 方法進(jìn)行復(fù)檢[8,10]，比較二者的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 單一PCR 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定 分別以PPV2、PPV3、PPV6 核酸樣品為模板，利用對應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段約為600 bp、200 bp、500 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD18-T，挑選單菌落，經(jīng)PCR 和測序鑒定，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，分別命名為pMD18-PPV2、pMD18-PPV3、pMD18-PPV6。

圖1 單一PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification by single PCR

2.2 多重PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化 參考單一PCR 反應(yīng)條件，通過對引物濃度、退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL、PPV2（10 μmol/L）上下游引物各

1.50 μL、PPV3（10 μmol/L）上下游引物各1.00 μL、PPV6（10 μmol/L）上下游引物各1.25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30 個循環(huán)；72 ℃7 min。

2.3 特異性試驗 應(yīng)用建立的多重PCR 方法，以不同病原DNA 或cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，建立的多重PCR 方法僅能擴(kuò)增PPV2、PPV3、PPV6 的基因組DNA，且與預(yù)期大小相符，而 對 PCV2、 PRV、 HPS、 APP、 JEV、 PEDV、PRRSV 的核酸均無特異性擴(kuò)增（圖2）。表明本研究建立的方法特異性較強(qiáng)。

圖2 多重PCR 特異性試驗Fig.2 Specificity tests of the multiplex PCR

2.4 敏感性試驗 3種重組質(zhì)粒10倍倍比稀釋，并以稀釋度相同的質(zhì)粒等量混合作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，多重PCR方法對PPV2、PPV3、PPV6 的重組質(zhì)粒最低檢測限分別為4.32×103拷貝/μL、9.62×103拷 貝/μL、4.25×103拷貝/μL，與單一PCR 方法對PPV2、PPV3、PPV6 的重組質(zhì)粒最低檢測限一致（圖3）。表明本研究建立的多重PCR 方法敏感性較高。

圖3 多重PCR 敏感性試驗Fig.3 Sensitivity tests of the multiplex PCR

2.5 臨床樣品檢測 采用建立的多重PCR 方法對25 份豬流產(chǎn)胎兒組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示3 次重復(fù)性檢測結(jié)果一致，PPV2陽性率為12%（3/25），PPV3陽性率為16%（4/25），PPV6 陽性率為16%（4/25）。其中PPV2、PPV3 混合感染率為12%；PPV2、PPV6 混合感染率為12%，PPV3、PP6 混合感染率為16%，3種PPV 混合感染率為12%。利用已報道的單一PCR進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果與多重PCR 檢測結(jié)果一致，兩種方法符合率100%，表明本研究建立的多重PCR 方法可以用于臨床樣品檢測。

3 討 論

本實驗室前期利用宏病毒組學(xué)技術(shù)檢測患有豬繁殖障礙綜合征樣品，發(fā)現(xiàn)PPV 感染率較高，且存在多型PPV 混合感染的情況。結(jié)合國內(nèi)外其他學(xué)者報道的多種PPV混合感染、PPV與PCV2混合感染的案例，表明PPV在豬群中的感染情況不容小視[11-13]。但現(xiàn)今檢測PPV 的方法以單一PCR 方法與血清學(xué)方法為主，并不針對多型PPV 混合感染，因此建立多重PCR方法，將為研究PPV在我國流行情況提供技術(shù)支持。

多重PCR 方法是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，達(dá)到同時擴(kuò)增多個片段的目的[14]。多重PCR 反應(yīng)過程中可能存在引物之間的相互抑制，引物二聚體的出現(xiàn)及引物與非靶序列之間的結(jié)合而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增[15]，因此引物設(shè)計、各引物之間的比例、退火溫度、循環(huán)數(shù)的優(yōu)化均尤為重要。為了建立特異性較強(qiáng)的多重PCR 檢測方法，本研究通過分析PPV2、PPV3、PPV6 的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS 基因序列，發(fā)現(xiàn)三者之間同源性不高，因此根據(jù)各自NS 基因序列保守區(qū)設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增的目的片段大約相差100 bp～200 bp，通過優(yōu)化退火溫度、循環(huán)數(shù)及各引物的終濃度，最終試驗結(jié)果表明利用本研究設(shè)計引物建立的多重PCR對PPV2、PPV3、PPV6的核酸擴(kuò)增效果良好，對PCV2、PEDV、PRRSV、PRV、HPS、APP、JEV 的核酸均無有效擴(kuò)增，且凝膠電泳結(jié)果清晰，3個目的片段距離適中，結(jié)果易于觀察。

建立新的檢測方法，敏感性的考察必不可少。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒并以此為模板，以單一PCR 作為對照，對所建立的多重PCR 方法的敏感性做出評估。結(jié)果顯示，加入多對引物后其敏感性并未下降，每一種重組質(zhì)粒所能檢測的最低質(zhì)粒拷貝數(shù)仍然為103拷貝/μL。與已報道的單一PCR 方法相比較[10]，PPV2 和PPV3 對重組質(zhì)粒檢測的最低拷貝數(shù)均是103拷貝/μL，但本研究檢測PPV6 的敏感性比已報道的定量PCR 方法低100 倍[8]，其原因可能是多數(shù)情況下定量PCR 方法本身敏感性比普通PCR 方法敏感性高，從而導(dǎo)致了兩種方法敏感性的不同。利用建立的多重PCR方法與已報道過的單一PCR方法同時檢測25份臨床樣品時檢測結(jié)果一致，表明該方法可以替代單一PCR方法，用于對3種PPV進(jìn)行臨床檢測。

本研究建立了一種能同時檢測PPV2、PPV3、PPV6 的多重PCR 方法，可用于PPV 單獨(dú)感染與混合感染的快速檢測，具有良好的特異性、敏感性，為了解PPV 流行情況提供了技術(shù)支持。