人源H7N9 流感病毒促進I 型干擾素產生機制的研究

李繼清，萬曉朋，于曉菲，陳化蘭

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

自2013 年首次發(fā)現以來，H7N9 流感病毒給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經濟損失，并且，新型H7N9 病毒可以突破種間障礙直接感染人，更為嚴重的是，病毒不斷變異，2017 年在家禽和患者體內均分離到高致病性H7N9 流感病毒[1-2]。截止2019 年2 月，H7N9 流感病毒共導致1 567 人感染，其中有615 人死亡，死亡率高達39%，對人類公共衛(wèi)生安全構成了巨大的威脅[3]，因此，H7N9 流感的防控成為亟待解決的問題。

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防線，在病毒感染的早期階段，天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）識別病毒組分產生一系列抗病毒效應分子，其中I型干擾素（IFN-I）在抗病毒反應中發(fā)揮重要作用[4]。文獻報道，在流感病毒感染的過程中，主要由胞內的PRR 視黃酸誘導基因I（RIG-I）識別由病毒RNA 在細胞內復制時所產生的5'-pppssRNA 等產物，并通過接頭分子MAVS 招募并活化TANK 結合激酶1（TBK1）分子，最終通過磷酸化的干擾素調節(jié)因子3（IRF3）分子入核促進IFN-I 產生[5]。IFN-I 具有重要的抗病毒功能，不同來源的H7N9 病毒致病力不同，為研究不同宿主來源的H7N9 病毒誘導產生IFN水平差異及其機制，本實驗選取兩株不同來源的H7N9 流感病毒，一株人源病毒A/Anhui/1/2013（AH/1），另外一株是禽源病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013（PG/S1421），兩株病毒僅在PB2 627 位點有一個氨基酸差異，分別為K 和E，然而，兩株病毒對小鼠的致病性存在明顯差異，AH/1 株感染導致小鼠死亡，PG/S1421 株感染小鼠不發(fā)病。本研究利用AH/1 和PG/S1421 兩株病毒分別感染小鼠腹腔巨噬細胞，研究IFN-I 產生水平差異及其機制，結果顯示，AH/1 株可以通過上調RIG-I 的表達量，進而誘導產生更多的IFN-I，揭示了人源H7N9 病毒促進IFN-I 產生的初步機制，為進一步解析人源H7N9 流感病毒促進IFN-I 產生的精細分子機制以及逃逸宿主天然免疫系統(tǒng)的機制研究奠定了基礎，為H7N9流感防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 A549 細胞、H7N9 流感病毒PG/S1421 株和AH/1 株均由本實驗室保存；小鼠腹腔巨噬細胞取自C57BL/6 小鼠按照參考文獻[6]制備；實驗用C57BL/6 小鼠購自北京維通利華公司。

RPMI 1640 培養(yǎng)基、F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自GIBCO 公司；4%多聚甲醛購自索萊寶公司；Alexa Fluor?488 山羊抗鼠IgG、IFN-β ELISA 檢測試劑盒購自Invitrogen 公司；兔抗GAPDH、RIG-I 抗體和山羊抗兔IgG-HRP 均購自CST 公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）購自碧云天公司；H7N9 NP 單克隆抗體（anti-NP MAb）由本實驗室制備。

1.2 病毒對小鼠致病性試驗 將病毒株PG/S1421和AH/1分別10倍倍比稀釋為101EID50/50 μL～106EID50/50 μL，每個稀釋度取50 μL 滴鼻感染5 只6 周齡雌性C57BL/6小鼠，連續(xù)14 d 記錄兩組小鼠的體質量變化和死亡情況。以106EID50的PG/S1421 株和AH/1 株分別滴鼻感染5 只6 周齡雌性C57BL/6 小鼠，第6 d 時迫殺小鼠并無菌操作取小鼠的鼻甲、腦、肺、腎和脾5 個臟器分別放入2 mL EP 管，加入1 mL 含抗生素的PBS 和鋼珠用組織研磨儀研磨，離心后取上清，10 倍倍比稀釋后，分別以0.1 mL/胚的劑量尿囊腔接種9 日齡～10 日齡的雞胚，48 h 后收集尿囊液，測定兩株病毒雞胚尿囊液HA 效價，計算小鼠臟器病毒滴度。

1.3 病毒對細胞的感染效率檢測 將A549 細胞和小鼠腹腔巨噬細胞鋪于6 孔板，待細胞貼壁時用兩株流感病毒PG/S1421 和AH/1 以相同劑量（MOI 5）分別感染A549細胞和小鼠腹腔巨噬細胞，8 h后加入4%多聚甲醛固定，經Triton-X100透膜、BSA封閉后，以anti-NP MAb（1∶200）為一抗，加入Alexa Fluro 488 標記的山羊抗鼠IgG（1∶500）為二抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）檢測細胞熒光，同時采用流式細胞術測定感染細胞的比例，根據流式結果的峰圖及統(tǒng)計學分析結果判斷兩株病毒感染細胞效率的差異。實驗設未經病毒感染的細胞孔作為陰性對照（NC）。

1.4 病毒感染細胞后的IFN-β含量的檢測 待6孔板中的小鼠腹腔巨噬細胞貼壁時，將兩株病毒PG/S1421和AH/1 以MOI 1 的劑量分別感染細胞，分別在感染后0、2 h、6 h、12 h 時取細胞培養(yǎng)上清，采用IFN-β ELISA 檢測試劑盒測定兩株病毒感染細胞培養(yǎng)上清中IFN-β的含量，對實驗數據進行分析比較。實驗設未經病毒感染的細胞作為陰性對照（NC）。

1.5 病毒感染細胞后的RIG-I 表達量的檢測 兩株病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞的方式同1.4，感染后在0、4 h、8 h、12 h 時裂解細胞收取總蛋白，熱變性處理后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，經濕轉法轉至PVDF 膜上，5%脫脂乳室溫封閉90 min，分別以兔抗GAPDH 抗體（1∶1 000）、兔抗RIG-I 抗體（1∶1 000）為一抗，山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，經western blot 檢測感染細胞中RIG-I 的表達水平。

1.6 統(tǒng)計分析 感染效率的流式數據用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計整理，試驗結果采用unpaired t-test方法分析。

2 結 果

2.1 兩株病毒對小鼠的致病性試驗結果 本研究采用不同劑量的兩株流感病毒經滴鼻感染C57BL/6小鼠，連續(xù)記錄小鼠的體質量變化和死亡情況，結果顯示，106EID50劑量的PG/S1421 株感染小鼠不會造成其體質量下降和發(fā)病死亡（圖1A、1C）；AH/1株以較低劑量（101EID50～103EID50）感染小鼠時，不會對小鼠體質量變化造成影響，用104EID50劑量感染小鼠會導致小鼠體質量輕微下降，而以高劑量（105EID50和106EID50）感染小鼠時，會導致小鼠體質量顯著下降并最終死亡（圖1B、1D）。為檢測兩株病毒在小鼠體內臟器中的復制情況，將小鼠臟器研磨液上清接種雞胚并計算EID50，結果顯示，PG/S1421 株和AH/1 株感染的小鼠，在肺臟和鼻甲中均可以檢測到病毒，與PG/S1421 株感染組相比，AH/1株感染組小鼠在肺臟和鼻甲中的病毒滴度分別高103倍和近104倍，但兩組小鼠在腦、腎和脾中均檢測不到病毒（圖1E、1F）。結果表明兩株病毒對小鼠的致病性存在顯著差異，AH/1 株感染后在小鼠體內的病毒滴度高于PG/S1421 株，并且造成小鼠體質量下降和死亡，對小鼠致病性更強。

圖1 PG/S1421 株和AH/1 株對小鼠的致病性試驗結果Fig.1 Pathogenicity test of PG/S1421 and AH/1 in mice

2.2 病毒對細胞感染效率的檢測結果 分別通過IFA 和流式細胞術檢測兩株流感病毒PG/S1421 和AH/1 對不同宿主細胞的感染效率，IFA 實驗結果顯示兩株病毒感染A549 細胞和小鼠腹腔巨噬細胞的熒光數量和強度無明顯差別（圖2A），流式結果顯示兩株病毒感染兩種細胞后的感染細胞數量無明顯差別（p=0.5026 和p=0.6379）（圖2B），表明兩株病毒在A549細胞和小鼠腹腔巨噬細胞中的感染效率無差別。

圖2 PG/S1421 株和AH/1 株感染細胞后感染效率的檢測結果Fig.2 Infection efficacy after the cell infected with PG/S1421 and AH/1

2.3 病毒感染細胞后IFN-β 表達量的檢測結果利用IFN-β ELISA 檢測試劑盒檢測兩株病毒感染后小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中IFN-β的蛋白含量。結果顯示，在感染后一定時間內，兩株病毒均可以促進細胞中IFN-β表達，并且IFN 的表達量隨時間的延長而增加（圖3），但是相較于PG/S1421，AH/1株能夠誘導產生更多的IFN-β，結合2.2 中結果，兩株H7N9病毒對宿主細胞的感染效率不存在顯著差異，表明IFN 含量差異不是由于感染效率不同引起的。

圖3 PG/S1421 株和AH/1 株感染巨噬細胞后的IFN-β表達水平檢測結果Fig.3 IFN-β expression in macrophages infected with PG/S1421 and AH/1

2.4 病毒感染細胞后胞內RIG-I 表達量的檢測結果對IFN-I 通路中的RIG-I 表達量進行western blot 檢測。結果顯示，在PG/S1421 株感染細胞的12 h 內，胞內RIG-I 分子的表達量無顯著性變化，而AH/1 株感染則可以上調RIG-I 的表達量，并且表達量呈現出隨時間延長而上升的趨勢（圖4），表明AH/1 感染可以上調RIG-I 的表達量進而促進IFN-I 的產生，這與

2.3 中ELISA 方法檢測IFN-β含量上升的結果一致。

圖4 PGS1421 株和AH/1 株感染巨噬細胞RIG-I 表達量的檢測結果Fig.4 RIG-I expression in macrophages infected with PG/S1421 and AH/1

3 討 論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，流感病毒感染時，單核巨噬細胞可以迅速趨化到感染部位清除病毒感染。本研究利用禽源和人源H7N9 病毒感染小鼠，對兩株病毒在C57BL/6 小鼠中的致病性進行評價，結果顯示兩株病毒在小鼠體內的復制效率以及對小鼠的致病力不同，人源H7N9 病毒感染可以導致小鼠發(fā)病死亡，而禽源病毒感染被快速清除，表明人源H7N9 病毒可能逃避了天然免疫的清除。

H7N9 流感病毒PG/S1421 株和AH/1 株在PB2 蛋白的627 位點有一個氨基酸的差異，早先有研究報道，流感病毒的PB2 蛋白可以和線粒體抗病毒信號蛋白相互作用，抑制IFN-I 的產生從而影響病毒毒力[7]，這可能導致兩株病毒的PB2 蛋白在與宿主蛋白的相互作用方面存在差異，從而對IFN-I 的產生造成影響。本研究用兩株病毒感染細胞并對IFN 表達量進行檢測，結果表明人源H7N9 病毒AH/1 株誘導機體產生更多的IFN-I。

為探究AH/1 株誘導細胞產生更多IFN-I 的機制，對兩株H7N9 流感病毒在小鼠腹腔巨噬細胞中的感染效率進行測定，結果顯示兩株病毒在吸附和感染方面沒有顯著差異，表明感染效率不是造成兩株H7N9 流感病毒誘導產生IFN-I 差異的原因。流感病毒主要是通過RIG-I/MAVS/IRF3 這條通路誘導IFN-I 產生[8]，本研究利用兩株病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞，對IFN-I 產生信號通路中的RIG-I 表達量進行檢測，結果顯示AH/1 株感染的巨噬細胞中RIG-I的表達量隨感染時間延長而不斷增加，表明人源H7N9 流感病毒感染通過上調細胞中RIG-I 的表達量進而促進IFN-I 的產生。

天然免疫是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防線，IFN-I 是天然免疫反應中的關鍵成員，發(fā)揮重要的抗病毒作用。流感病毒感染宿主的早期階段，病毒與宿主天然免疫系統(tǒng)相互抗爭，病毒感染會激活宿主的天然免疫系統(tǒng)，誘導IFN 產生，發(fā)揮清除病毒的作用[9-10]。綜上所述，本研究表明PG/S1421 株和AH/1 株感染均可以誘導細胞IFN-I 產生，但相較PG/S1421，AH/1 株可以通過上調細胞中RIG-I 的表達量，進而促進更多IFN-I 的產生，初步揭示了人源H7N9 病毒促進細胞IFN-I 產生的原因，為進一步闡明人源H7N9 流感病毒上調RIG-I 的精細分子機制以及人源H7N9 免疫逃逸機制研究奠定了基礎。