牙周基礎(chǔ)治療對(duì)慢性牙周炎患者非刺激性全唾液、齦溝液及血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-13水平的影響

楊琦 穆森 詹淵博 閆穎 王艷 張瑞敏

牙周炎是一種由細(xì)菌感染和宿主免疫反應(yīng)兩者之間相互作用所引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病。細(xì)菌感染導(dǎo)致白細(xì)胞活性升高與細(xì)胞因子分泌增加, 及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與類花生酸的增加, 從而導(dǎo)致宿主介導(dǎo)牙周支持組織的破壞，其中MMP在牙周組織的破壞中起重要作用[1]。MMP-13作為MMP家族的第三成員，是一種由成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、牙髓細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)的具有較強(qiáng)溶膠作用的膠原酶[2]。其表達(dá)由人β牙齦成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長因子3型(TGFβ3)誘導(dǎo)，并被2型金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-2)抑制[3]。MMP-13的作用底物最廣，除可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ天然膠原酶、韌粘素、纖連蛋白等，還能使軟骨的纖維結(jié)構(gòu)受損，造成骨和軟骨的破壞[4]。本實(shí)驗(yàn)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)，分析牙周炎患者治療前后齦溝液、唾液以及血清中MMP-13的變化及其與臨床指數(shù)的相關(guān)性，以探討MMP-13與牙周炎發(fā)病機(jī)制、診斷及治療預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組 共有20 名患者(10 名男性，10 名女性，年齡30～59 歲)，選自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科。在參與之前，向所有患者充分解釋了本實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮统绦?，并且每個(gè)患者均簽署書面知情同意書。受檢者符合1999 年牙周病分類國際研討會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]，同時(shí)具備以下條件者：①?zèng)]有全身性疾病者(糖尿病，心臟病，免疫性疾病等可能影響牙周病病程的疾病)；②在近6 個(gè)月內(nèi)未做過牙周基礎(chǔ)治療者；③近6 個(gè)月內(nèi)未使用抗生素，抗炎藥物或免疫抑制藥物等可影響牙周表現(xiàn)或影響研究結(jié)果者；④無吸煙(包括從不吸煙和至少戒煙10 年以上者)習(xí)慣者；⑤全口余留牙大于10 個(gè)以上者均可納入。

1.1.2 對(duì)照組 選取本院各科同意參加本研究的工作人員及患者中的牙周健康者20 例 (男10 例,女10 例,年齡25～52 歲 )。受檢者符合以下條件：①無系統(tǒng)性疾?。虎诮? 個(gè)月未使用抗生素及免疫制劑；③近3 個(gè)月未進(jìn)行牙周藥物及手術(shù)治療；④婦女未妊娠；⑤齦溝深度<2 mm，齦溝探診不出血，無明顯牙齦退縮。所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

初診時(shí)進(jìn)行臨床指標(biāo)的檢測(cè)并采集 GCF、非刺激性唾液以及血清, 然后分別進(jìn)行齦上潔治和齦下刮治等牙周基礎(chǔ)治療, 同時(shí)給予口腔衛(wèi)生指導(dǎo)。治療結(jié)束后6 周再次檢測(cè)臨床指標(biāo)和GCF、非刺激性唾液和血清的樣品采集。所有牙周炎患者的牙周基礎(chǔ)治療均由同一口腔醫(yī)師完成。在牙周基礎(chǔ)治療后沒有使用抗生素等任何其他藥物。

1.3 臨床指標(biāo)的檢測(cè)

檢測(cè)待測(cè)牙的出血指數(shù)(bleedingindex，BI)，牙周探診深度(probingdepth，PD)，臨床附著喪失指數(shù)(clinicalat-tachmentloss，CAL)等。臨床指標(biāo)均檢測(cè)牙齒的頰側(cè)近中、頰側(cè)中央、頰側(cè)遠(yuǎn)中、舌側(cè)近中、舌側(cè)中央、舌側(cè)遠(yuǎn)中6 個(gè)位點(diǎn)并取其平均值。臨床檢查均由同一名口腔醫(yī)師在統(tǒng)一光源下使用統(tǒng)一規(guī)格器械完成。

1.4 唾液標(biāo)本采集

由同一口腔醫(yī)師收集所有參試者的非刺激性全唾液，采集時(shí)間為上午9：00～10：00，采集前禁食2 h。采集時(shí)要求參試者用無菌蒸餾水含漱3 min后全部吐出，保持不吞咽、不說話并靜坐10 min，用5 ml吸引器吸取自然狀態(tài)下非刺激分泌的全唾液5 ml，注入無菌Eppendorf管。所得的樣本立即送實(shí)驗(yàn)中心，14 000 g/min離心5 min，-80 ℃凍存統(tǒng)一待測(cè)。

1.5 齦溝液(GCF)采集

首先選取1 個(gè)上前牙的近遠(yuǎn)中鄰面位點(diǎn)和1 個(gè)第一磨牙近遠(yuǎn)中鄰面位點(diǎn)，且牙齒頸部無齲損和充填體。刮除其齦上大塊牙石菌斑，用棉卷隔濕待測(cè)牙并輕輕吹干牙面，然后用Whatman濾紙制成的2 mm×10 mm濾紙條分別輕輕插入每個(gè)待測(cè)牙的齦溝或牙周袋內(nèi)，直到感覺有輕微阻力為止，靜置30 s后取出(如被血液污染則除)，立即放入Eppendorf管中密封于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。以上操作由同一口腔醫(yī)師完成。

1.6 血清標(biāo)本采集

隔夜空腹后的清晨或上午抽取被納入對(duì)象的肘正中靜脈血4 ml，4 ℃靜置待血液充分凝固后用臺(tái)式離心機(jī)以3 000 r/min，離心10 min(離心半徑為8 cm)，分離血清后分裝，-80 ℃凍存統(tǒng)一待測(cè)。

1.7 ELISA方法檢測(cè)非刺激全唾液、齦溝液和血清中MMP-13水平

-80 ℃冰箱中取出GCF、唾液、血清樣本，放置室溫下解凍，裝有GCF樣本的EP管中分別加入200 μl去離子水在室溫下震蕩10 min，4 ℃低溫離心機(jī)中以14 000 r/min離心5 min(離心半為10 cm)，取上清液備用。ELISA試劑盒測(cè)定非刺激性全唾液、齦溝液及血清中 MMP-13水平(ELISA試劑盒購自武漢市BOSTER生物科技有限公司)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照所附說明書操作，并用酶標(biāo)分析儀在450 nm處測(cè)量各孔吸光度(A值)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣品A值從而計(jì)算樣本中MMP-13的水平進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.01軟件，若各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布或者方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)：牙周基礎(chǔ)治療前、后各組間MMP-13水平及臨床指標(biāo)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；治療前、后與健康對(duì)照組間MMP-13水平及臨床指標(biāo)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Mann-Whitney-U檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用spearman相關(guān)性分析分析疾病組前后非刺激性全唾液、血清及齦溝液中MMP-13水平與PD、CAL、BI的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周基礎(chǔ)治療前后臨床指標(biāo)的比較

慢性牙周炎基礎(chǔ)治療后 BI、PD 均有顯著性改善(P<0.05)；CAL未見明顯改變(P>0.05)(表 1)。

Tab 1 Clinical parameters before and after treatment n=20)

2.2 MMP-13水平比較

在非刺激性全唾液中患者治療前、 后MMP-13水平均高于健康對(duì)照組(P<0.05)，治療后明顯降低(P<0.05)(表 2)。治療后降低不顯著(P>0.05)

在齦溝液中，患者治療前MMP-13水平顯著高于治療后(P<0.05)，治療前水平高于健康對(duì)照組(P<0.05)，治療后與健康組差異不大(P>0.05)(表 2)。

在血清中，患者治療前MMP-13水平顯著高于治療后(P=0.004 3)，患者治療前MMP-13水平高于健康對(duì)照組(P<0.05)； 而慢性牙周炎患者治療后MMP-13水平與健康對(duì)照組相比差異不大(P>0.05)(表 2)。

Tab 2 Comparison of MMP-13 levels before and after the treatment( pg/ml)

注：患者治療前與健康對(duì)照組相比，①P<0.05，患者治療后與健康對(duì)照組相比，②P>0.05

2.3 各組臨床指標(biāo)與非刺激性全唾液、齦溝液及血清中MMP-13水平相關(guān)性

經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療6 周后，慢性牙周炎患者的平均BI與非刺激性全唾液及齦溝液中MMP-13水平相關(guān)，并較治療前平均BI明顯改善(P<0.05)(表 3)。慢性牙周炎患者治療前及治療后的平均PD與齦溝液中MMP-13水平相關(guān)(P<0.05)(表 3)。

3 討 論

膠原蛋白是牙齦和牙周膜的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分，在活動(dòng)性牙周炎期間，MMP-13通過自身蛋白質(zhì)水解或其他MMP的催化等方式活化后發(fā)揮其降解膠原蛋白的能力，導(dǎo)致牙周組織有機(jī)基質(zhì)的破壞。牙齦結(jié)合上皮通過內(nèi)部基底層中的半橋粒粘附于牙齒，半橋粒由層粘連蛋白-5和整合素α6β4組成，有研究表明，MMP-13能夠降解牙齦基底膜中的層粘連蛋白-5的γ2鏈，加速牙周袋的形成[6-7]。并且MMP-13與組織蛋白酶K和MMP-9協(xié)同降解骨基質(zhì)中的I型膠原蛋白而加速牙槽骨的吸收。

齦上潔治、齦下刮治和根面平整能有效的去除附著在牙面和根面的牙石和菌斑以及肉芽組織，在獲得良好的菌斑控制后，絕大多數(shù)患者的臨床狀況都會(huì)改善。本研究結(jié)果也表明：牙周基礎(chǔ)治療后，除了CAL外，牙周炎患者的BI、PD水平都有顯著降低(P<0.05)。且在本研究中，慢性牙周炎患者經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后除非刺激性唾液外，齦溝液、血清中MMP-13水平均較治療前顯著降低(P<0.05)，但在血清中MMP-13表達(dá)水平較低。對(duì)慢性牙周炎患者治療前、后非刺激性唾液、齦溝液以及血清中 MMP-13 含量與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示：慢性牙周炎患者的BI與PD齦溝液中的MMP-13水平呈正相關(guān)，且BI與慢性牙周炎患者的非刺激性唾液呈正相關(guān)。提示齦溝液水平更能全面評(píng)估牙周炎的預(yù)后。Pawar等[8]通過ELASA檢測(cè)證實(shí)通過牙周基礎(chǔ)治療后齦溝液中MMP-13顯著降低。許多學(xué)者通過對(duì)慢性牙周炎患者的GCF分析得出相同的結(jié)論：MMP-13在牙周炎患者齦溝液中高表達(dá)，可以獨(dú)立作為牙周炎的診斷分子,且與牙周炎患者非活動(dòng)性位點(diǎn)以及健康人相比較，牙周炎患者活性位點(diǎn)具有更高水平的MMP-13活性[9-11]。

表 3 患者M(jìn)MP-13水平與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性(n=20)

Tab 3 Correlation of clinical parameters with MMP-13 levels in the patients(n=20)

項(xiàng) 目非刺激性全唾液中MMP-13水平齦溝液中MMP-13水平血清中MMP-13水平治療前組治療后組治療前組治療后組治療前組治療后組r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值BI-0.040.490.370.030.120.680.420.02-0.040.60-0.050.38PD(mm)-0.140.61-0.310.240.690.0040.650.04-0.140.590.190.49CAL(mm)-0.010.910.080.76-0.220.43-0.340.780.040.870.120.91

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：慢性牙周炎患者唾液中MMP-13水平治療后比治療前的低，但是差異不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ?zcan等[12]所做出來的結(jié)論與本研究一致。Virtanen等[13]通過對(duì)牙周炎患者與牙周健康的人的唾液中MMP-13水平分析得出健康人唾液中MMP-13比牙周炎患者水平高的結(jié)果，本研究結(jié)果與其不一致。分析其原因可能是：MMP-13最初在人乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，其在治療后的高表達(dá)可能與女性性激素水平有關(guān)。Collazos等[14]在體外研究中，用IL-1β刺激牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP-13，孕激素似乎能降低MMP-13的表達(dá)水平。在小鼠皮膚的鱗狀細(xì)胞癌中，雌激素對(duì)MMP-13抑制劑的治療有明顯的調(diào)節(jié)作用，年齡較大的雌性小鼠具有較高水平的MMP-13[15]。除此之外，Yang 等[16]在結(jié)扎小鼠牙齒頸部致小鼠患牙周炎的實(shí)驗(yàn)性牙周炎的模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MMP-13在牙周炎發(fā)展的不同時(shí)期有不同的含量變化。盡管牙周基礎(chǔ)治療后牙周炎的臨床參數(shù)有所改善，但亞急性炎癥過程仍可繼續(xù)，與治療前相比高M(jìn)MP-13水平很可能是由于亞臨床水平的持續(xù)破壞。

本實(shí)驗(yàn)研究了MMP-13與牙周炎的關(guān)系。檢測(cè)MMP-13在齦溝液中表達(dá)水平有助于牙周炎的診斷以及預(yù)后的評(píng)估。許多疾病都可以在唾液中找到相關(guān)的蛋白分子標(biāo)記物。同時(shí)，唾液的取樣還具有無創(chuàng)、便捷等優(yōu)點(diǎn)，因此MMP-13在唾液中的表達(dá)水平變化值得進(jìn)一步考慮。