伴放線放線桿菌中幽門螺桿菌毒力相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

孫靜華 張琛 侯本祥

Sun等[1]對(duì)35例胃癌前病變患者以及70 例同年齡段健康者的口腔狀況進(jìn)行評(píng)估時(shí)發(fā)現(xiàn)，胃癌前病變與牙周疾病有關(guān)，且胃癌前病變患者口腔中的菌群相對(duì)于健康者比較單一，表現(xiàn)為主要牙周致病菌有所增高?？梢娧乐懿?duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性，可能與口腔的菌群變化有關(guān)。

幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)，與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和癌、胃潰瘍和癌的發(fā)生有關(guān)[2-4]，牙周病患者齦下菌斑中Hp的檢出率明顯高于健康人群[5]。細(xì)胞毒素相關(guān)基因(cytotoxinassociatedgeneA，cagA)是Hp最重要的毒力因子之一，位于Hp基因組中約40 kb的特殊DNA區(qū)域，該DNA片段被稱為細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A致病島(cag pathogenicity island，cagPAI)[6]。cagPAI包含多個(gè)基因，可編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅳsecretion system，T4SS)的主要成分，包括cagE(cytotoxinassociatedgeneE)等，并與毒素裝配和分泌有關(guān)[7]。CagA蛋白可通過cagPAI編碼的T4SS進(jìn)入上皮細(xì)胞，經(jīng)過磷酸化后與蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2結(jié)合，所形成復(fù)合物可抑制SHP-2的活性，誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞的異常遷移和增殖[8-9]。因此cagA及其毒力島基因被認(rèn)為是胃炎的發(fā)生、發(fā)展甚至癌變的重要因子。Hp的另一個(gè)重要毒力因子是空泡毒素(vacuolating cytotoxin A，vacA)編碼的VacA蛋白，能通過與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞產(chǎn)生空泡性病變，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放造成胃上皮細(xì)胞的死亡[10]。

伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitans，Aa)是牙周病的主要致病菌之一，與侵襲性牙周炎密切相關(guān)[11-12]。Aa可分泌合成多種毒力因子，能通過改變宿主細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，影響宿主的免疫調(diào)節(jié)能力，破壞牙周組織[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，Aa與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)，胃癌前病變患者口腔中的Aa顯著高于健康對(duì)照組[1]，提示牙周病和胃癌的主要致病菌間可能存在一定的協(xié)同作用。本研究根據(jù)Hp的cagPAI基因及vacA基因，用Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)并通過同源比對(duì)的方法分析Aa中是否存在對(duì)應(yīng)的基因；通過進(jìn)化樹分析及序列多態(tài)性分析，研究進(jìn)化過程中致病基因的序列變化及其受到的選擇情況，為進(jìn)一步闡述牙周病和胃癌的相關(guān)性提供一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Aa菌株蛋白序列的獲得

首先從ncbi的下拉框中選擇protein條目，并用關(guān)鍵詞A.actinomycetemcomitans查詢Aa的所有蛋白序列；然后在refseq中下載Hp26695的所有cagPAI及vacA基因的蛋白序列，同時(shí)利用blastP法查找Aa中對(duì)應(yīng)的蛋白序列(E值為10-5)；最后用在線工具Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測(cè)cagPAI及vacA基因的蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/bacteria/)中下載所有包含完整基因組序列的菌株，根據(jù)Hp26695的cagE基因序列，并用tblastn的方法獲得除Hp26695外其它菌株中對(duì)應(yīng)的cagE序列。對(duì)于有多個(gè)菌株的菌種，則根據(jù)tblastn的比對(duì)結(jié)果，選取E值最小的菌株作為該菌種的代表菌株。利用MEGA[15]對(duì)所有菌株的cagE進(jìn)行進(jìn)化樹分析：首先利用Muscle進(jìn)行多重比對(duì)，比對(duì)時(shí)使用默認(rèn)的參數(shù)；再用極大似然法(Maximum likelihood，ML)建樹，建樹時(shí)bootstrap的值為100，其余參數(shù)選默認(rèn)值。

1.3 cagE序列多態(tài)性分析

根據(jù)Aa和Hp的蛋白序列，用tblastn法分別查找所有Aa菌株和Hp菌株的cagE序列，經(jīng)ClustalW多重比對(duì)后進(jìn)行序列多態(tài)性分析，DNAsp 5.0法[16]計(jì)算比對(duì)cagE序列的Pi值和Tajima's D值。Tajima檢驗(yàn)根據(jù)多重比對(duì)中每條序列的分離位點(diǎn)數(shù)目以及每條序列的核苷酸多樣性值計(jì)算得到D值，作為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量，利用模擬(simulation)法得到相應(yīng)的P值。

2 結(jié) 果

2.1 Aa中Hp毒力相關(guān)基因的查找

從ncbi下載Aa中所有的蛋白序列，共獲得105 610個(gè)蛋白序列。根據(jù)Hp26695所有cagPAI及vacA基因的蛋白序列，并利用blastP法進(jìn)行查找，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Aa中有4個(gè)cagPAI基因的同源基因，分別為cagBeta、cagY、cagX及cagE，其中以cagE的E值最顯著(表 1)。然而，在Aa中未發(fā)現(xiàn)空泡毒素及其他毒力島基因的蛋白序列。cagY、cagX和cagE均是T4SS的組成成分，與毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[7]。

Aa中cagE的蛋白序列長(zhǎng)度為340 個(gè)氨基酸，與Hp中cagE的蛋白序列(983 個(gè)氨基酸)相比較短。對(duì)Aa和Hp的cagE的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者的序列相似性只有18%(圖 1)。 圖 1表明，Aa中cagE的蛋白序列主要比對(duì)到Hp的C端區(qū)域，當(dāng)忽略N端未比對(duì)的區(qū)域后，兩者的相似性可達(dá)到40%。

2.2 CagE蛋白結(jié)構(gòu)域分析

用Interpro對(duì)CagE蛋白在Aa和Hp兩個(gè)物種中的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示，Hp的CagE蛋白主要包含兩個(gè)功能域，其中1 個(gè)在N端，序列較短(約50 個(gè)氨基酸)，具有P型ATP酶活性，屬于跨膜蛋白超家族；另1 個(gè)在C端，序列較長(zhǎng)(約330個(gè)氨基酸)，為核苷三磷酸水解酶的磷酸環(huán)，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白傾向于水解ATP或GTP(圖 2A)。Aa的CagE蛋白含有3 個(gè)比較明顯的結(jié)構(gòu)域，其N端的結(jié)構(gòu)域較短，為溶菌酶樣結(jié)構(gòu)域超家族的成員；而其C端則與Hp類似，也是包含有核苷三磷酸水解酶的磷酸環(huán)結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度顯著小于Hp的CagE蛋白(圖 2B)。

2.3 cagE基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

從ncbi中下載所有含完整基因組序列的菌株，同時(shí)利用tblastn法，并根據(jù)Hp26695的cagE基因序列，查找其它菌株中是否含有cagE基因。對(duì)于同一菌種的不同菌株，則選取E值最小菌株的cagE序列作為該菌種的cagE序列。對(duì)所有菌種的cagE基因序列進(jìn)行多重比對(duì)后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖 3所示：對(duì)于多數(shù)同屬不同種的菌株，其cagE均聚在同一分支上，如布魯氏菌屬(Breculla)和巴爾通氏體屬(Bartonella)等；然而，Hp與其它螺桿菌屬的細(xì)菌并未聚在同一分支上(圖 3中紅色箭頭部分)，表明該屬菌種的cagE序列有較大的變異；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與其它螺桿菌屬的菌種相比，Aa(圖 3中藍(lán)色箭頭部分)在進(jìn)化樹上更靠近Hp，表明兩者的cagE序列在進(jìn)化上較為保守。

表1 Aa中Hp毒力相關(guān)基因的同源性分析

注：blastP比對(duì)后得到的E值，E值越小表示在Aa中無對(duì)應(yīng)蛋白的可能性越大; NA：表示blastP比對(duì)后在Aa中未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的蛋白

A:Hp的CagE全長(zhǎng)蛋白與Aa的比對(duì)； B:Hp的CagE蛋白C端與Aa的比對(duì)

圖1Aa和Hp的CagE蛋白保守性分析

Fig 1 Analysis of CagE protein sequence conservation inHpandAa

A: Hp的CagE蛋白結(jié)構(gòu)域； B: Aa的CagE蛋白結(jié)構(gòu)域

2.4 cagE基因DNA序列的多態(tài)性分析

從ncbi中下載含有完整基因組的44 個(gè)Hp菌株和8 個(gè)Aa菌株，tblastn檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有Hp菌株中均含有cagE基因，而且在8 個(gè)Aa菌株中有4 個(gè)菌株含有cagE基因，兩者均顯著高于Genbank中其他菌株的比例(15%)(P<0.05)(圖4)。由此可見，與其他非Hp相比，cagE基因普遍存在于Aa菌株中。

圖3cagE基因系統(tǒng)在細(xì)菌中的進(jìn)化樹分析[紅色箭頭：螺桿菌屬(Helicobacter)； 藍(lán)色箭頭：Aa]

Fig 3 Phylogenetic analysis ofcagEin bacteria

圖4 不同種細(xì)菌菌株中cagE的比例分析

Fig 4 Frequency analysis of the strains withcagEgene in different group of bacteria

用DNAsp 5.0計(jì)算Aa和Hp的cagE基因序列多態(tài)性的Pi值，及用Tajima's D計(jì)算其進(jìn)化過程中cagE基因在這兩個(gè)物種中所受到的選擇作用。結(jié)果顯示，Aa的Pi值顯著高于Hp(P<0.01)，表明Aa中的cagE基因有明顯的序列變化；而Tajima's D值則在Aa和Hp中均為負(fù)值，其Tajima's D對(duì)應(yīng)的P值都小于0.01，表明在其進(jìn)化過程中cagE基因在這兩個(gè)物種中均受到了負(fù)向選擇的作用(表 2)。

表2Aa和HpcagE基因的序列多態(tài)性分析

Tab 2 Polymorphism analysis ofcagEgene inH.pyloriandA.actinomycetemcomitanspopulations

細(xì)菌Pi值ThetaTajima'sDP值A(chǔ)a0.2937a0.3223-0.92647<0.001Hp0.1011b0.1515-1.21566<0.01

注：不同字母為P<0.01

3 討 論

cagA和vacA是Hp的主要致病基因。同時(shí)，cagA還是其所在的致病島區(qū)域的基因編碼及毒素裝配和分泌機(jī)能相關(guān)的蛋白，對(duì)Hp毒性的發(fā)揮具有重要作用。本文通過生物信息學(xué)方法，分析了Hp致病島區(qū)域的基因以及vacA基因在Aa中的存在及序列變化情況，發(fā)現(xiàn)Aa中并不存在cagA和vacA基因，但卻存在cagE等其它4 個(gè)致病島區(qū)域的基因。與其他物種相比，Hp和Aa中的cagE基因有著較近的進(jìn)化距離，在蛋白的C端均含有核苷三磷酸水解酶的磷酸環(huán)結(jié)構(gòu)域，且該基因在這兩個(gè)物種內(nèi)都受到負(fù)性選擇的作用。

cagE位于cagPAI的右半部分，主要定位在胞質(zhì)內(nèi)的ATPase，即可為分泌系統(tǒng)的組裝及底物轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量，又能與其他蛋白組成T4SS，對(duì)CagA轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[17-18]，而且在Hp的大部分菌株中都含有該基因。大量研究表明，cagE還與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，感染Hp的cagE陽(yáng)性菌株后，AGS和KATO-III等胃癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)重要因子IL-8表達(dá)升高[18]。有研究表明，十二指腸潰瘍與患者感染Hp的cagE陽(yáng)性菌株有關(guān)[19]。近年來的一些研究表明，在Aa中也存在cagE基因[20-21]。但與Hp不同的是，并不是所有的Aa菌株都含有cagE基因，該基因只存在于一部分Aa亞型的菌株中[20]。Aa菌株的cagE基因在牙周病中也扮演十分重要的角色[21]。與cagE陰性菌株相比，cagE陽(yáng)性菌株有著更為顯著的白細(xì)胞毒性，能作為一個(gè)重要的毒力因子而利于Aa菌株更好的定植在口腔中[20]。

對(duì)于其它3個(gè)在Aa中出現(xiàn)的Hp毒力島區(qū)域基因，cagX和cagY也是Type IV分泌系統(tǒng)組成成分，并在Hp中與CagA 的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[7]。在G-菌中有6種分泌系統(tǒng)[22]，T4SS所分泌的蛋白末端有一信號(hào)肽序列，其成份主要是疏水性氨基酸，可以引導(dǎo)蛋白穿過細(xì)胞內(nèi)膜而到達(dá)目標(biāo)區(qū)域[23]。由于T4SS能直接將毒素蛋白或毒素復(fù)合物等大分子物質(zhì)注入到宿主細(xì)胞中，并進(jìn)而參與病原-宿主間的相互作用，因此在病原菌毒性發(fā)揮中具有重要意義[7,24]。T4SS還能介導(dǎo)細(xì)菌吸收外界物質(zhì)，如Hp能通過T4SS的ComB系統(tǒng)從外界環(huán)境中獲得外界DNA序列[25]。Hp和Aa兩種細(xì)菌中多個(gè)T4SS的蛋白組分的序列保守暗示兩者在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性，因而可能有利于細(xì)菌間物質(zhì)的交流和傳播。

本課題組最近的一項(xiàng)研究表明，牙周病患者有較高的胃癌前病變風(fēng)險(xiǎn)，且該風(fēng)險(xiǎn)與患者口腔中較高的Aa菌株水平有關(guān)[1]。本文通過對(duì)Hp中毒力島基因以及空泡毒素基因在Aa中的存在情況及其序列變化的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)菌中T4SS的部分組分特別是CagE蛋白存在一定的保守性。結(jié)果揭示了兩種疾病關(guān)鍵的致病菌在分子水平存在一定的相似性，為進(jìn)一步研究牙周病與胃癌的關(guān)系提供了新的思路。

doi:10.1128/microbiolspec