偶氮苯修飾的發(fā)夾DNA對RNA轉(zhuǎn)錄的光調(diào)控*

陳露，季禾茗，莫蒙武，雷華軍，卜新雅，何裕建，封祿田?，吳麗?

(1 沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院， 沈陽 110142； 2 中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049； 3 廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院， 廣州 510006)

近年來，生物功能的人工控制因在細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)和生物納米技術(shù)中的廣泛應(yīng)用而受到關(guān)注。在基因表達(dá)的人工控制方面，人們通常應(yīng)用光、熱、電場和pH等各種外界刺激來實現(xiàn)。光由于非入侵的方式、時間和空間上的高分辨及無污染等特點在生物應(yīng)用中有著空前的優(yōu)勢。近年來，光已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到研究化學(xué)生物學(xué)、生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域, 尤其是利用光敏感核酸作為新的研究工具調(diào)控基因的功能, 極大地促進了基因功能分子學(xué)研究的發(fā)展，為后續(xù)的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

近年來，偶氮苯憑借著化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、光照后迅速發(fā)生異構(gòu)化等特點，成為光異構(gòu)化分子的典型代表之一[1-2]。以反式構(gòu)型(trans)為母體，由于該結(jié)構(gòu)趨于平面結(jié)構(gòu)，因此其熱力學(xué)性質(zhì)較其他結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，與此同時，在分別施加可見光(>400 nm)以及紫外光(UV<366 nm)的刺激后，前者能夠順利由順式構(gòu)型(cis)變化為trans構(gòu)型，后者則能夠轉(zhuǎn)變?yōu)閏is構(gòu)型，其具備的基本特征為穩(wěn)定性較低[3-5]。受上述特征的影響，偶氮苯類化合物得到廣泛應(yīng)用，在多個領(lǐng)域均發(fā)揮出重要作用[6-10]。

將偶氮苯引入到核酸分子中, 從時間和空間上調(diào)控生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)和生理體系方面也引起了科研工作者的廣泛興趣及重點關(guān)注。因此，這提供了一條可行性較高的核酸結(jié)構(gòu)改造途徑，即插入光響應(yīng)分子實現(xiàn)核酸結(jié)構(gòu)及其性能的改變，如引入到核糖體、核酸骨架等位置。通過上述方式改造核酸，進而實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄、核糖核酸酶的有效控制等[11-25]。另外，Tsai等[26]通過光-生物正交配體束縛在時空上控制蛋白質(zhì)活性的光學(xué)切換，利用光快速調(diào)節(jié)活哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)功能的選擇性。Reis等[27]使用可見光實現(xiàn)基于人組蛋白脫乙?；腹庵伦兩种苿┑谋碛^遺傳機制的高分辨率，設(shè)計一種表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)錄的化學(xué)光學(xué)調(diào)制探針，可以轉(zhuǎn)化為需要有條件和選擇性表觀基因組調(diào)節(jié)的疾病的新治療策略。Kamiya等[28]使用的光響應(yīng)性T7啟動子和偶氮苯衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)將光開關(guān)分子插入T7啟動子中的指定位置，在具有可見光的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中實現(xiàn)綠色熒光蛋白產(chǎn)生的有效光調(diào)節(jié)。Bian等[29]設(shè)計一種新型可重復(fù)使用的環(huán)糊精修飾表面，利用環(huán)糊精和偶氮苯之間的主客體相互作用實現(xiàn)光交換特定細(xì)胞釋放。

我們針對本研究進行積極的前期探索，并取得了一定成績，目前已順利實現(xiàn)4，4′-二羥甲基偶氮苯的發(fā)夾DNA開關(guān)的合成。該研究表明，發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性會在4，4′-二羥甲基偶氮苯的光異構(gòu)化的作用下發(fā)生變化，在這一過程中需要對反應(yīng)溫度進行控制(Δtm=24 ℃)[30-31]，另外，上述操作同樣能夠影響RNase H酶作用的降解，主要通過將其引入反義核酸兩端來實現(xiàn)。此外，還研究了DNA引物延伸相關(guān)的聚合酶鏈反應(yīng)的光調(diào)控。在這一過程中，需要重點關(guān)注一個因素，即穩(wěn)定雙鏈?zhǔn)欠衲軌蛐纬伞Ｒ虼?，需要插入保護鏈，形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，確保不發(fā)生引物延伸現(xiàn)象。通過紫外光照處理，可以脫去DNA模板的保護鏈，為后續(xù)引物結(jié)合操作創(chuàng)造條件，確保引物延伸能夠順利實現(xiàn)[32]。通過上述實驗操作保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。

本文提出對生命活動過程中核酸轉(zhuǎn)錄進行光調(diào)控，通過對DNA雙鏈的非模板鏈進行偶氮苯修飾，研究T7 RNA聚合酶催化下其指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的光調(diào)控可行性。參考常規(guī)含T7啟動子DNA模板研究RNA的轉(zhuǎn)錄，將偶氮苯引入非模板鏈的啟動子區(qū)域末端，然后分別連接5、7、9、11 nt的4種長度保護鏈。根據(jù)我們以前的研究，反式的偶氮苯使得非模板鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而紫外光照后的順式偶氮苯打破非模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。我們希望通過順反異構(gòu)化改變偶氮苯周圍的DNA雙鏈體的局部結(jié)構(gòu)，影響DNA與酶之間的相互作用，從而光調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄。此外，還通過改變在啟動子末端的保護鏈的長度詳細(xì)研究光調(diào)節(jié)效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較短長度修飾的偶氮苯保護鏈啟動子可以實現(xiàn)明確的光調(diào)節(jié)，進一步解釋了DNA模板雙鏈體的解離或雙鏈體的局部結(jié)構(gòu)影響光調(diào)節(jié)的機制。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

選用分析純試劑藥品。實驗所用常規(guī)藥品均購自于北京化工廠，主要有：石油醚(PE)、三乙胺(TEA)、無水硫酸鈉(Na2SO4)、乙酸乙酯(EA)、氯化鈉(NaCl)、200～300目硅膠、氫氧化鈉(NaOH)；自蕪湖華仁科技有限公司購入二氯甲烷(DCM)、乙腈(C2H3N)、四氫呋喃(THF)等，主要用于無水反應(yīng)，以及標(biāo)準(zhǔn)脫氧核苷亞磷酰胺單體用于DNA合成；自生工科技有限公司購入轉(zhuǎn)錄試劑、引物等分子試劑；自Thermo Fisher購入SYBR gold核酸染色劑；自寶如億科技有限公司購入T7 RNA 聚合酶。

1.2 主要儀器與設(shè)備

主要應(yīng)用到的儀器與設(shè)備有：1260高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫)、400 M核磁共振儀(AVANCE)、ChemiDoc XRS 高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、DNA 合成儀(AppliedBiosystems)、UV1800 紫外分光光度計(島津)。

1.3 偶氮苯衍生物修飾 DNA 的固相合成與純化

首先向合成柱中裝入Universal-CPG，裝入量為35 mg左右，即1 μmol，主要以CPG載體為依據(jù)。然后從5′到3′編輯目標(biāo)寡聚核苷酸序列，主要依據(jù)為雅磷酰胺單體的裝載位置規(guī)律。將DNA核苷亞磷酰胺單體由3′端向5′端向固相CPG的連接，均采取常規(guī)合成方法，具體參照相關(guān)操作手冊，在這一過程中使用的設(shè)備為ABI 394DNA/RNA固相合成儀。最后，想要順利得到目標(biāo)序列的固相，需要實現(xiàn)在CPG的寡聚核酸上亞磷酰胺單體的偶聯(lián)，每個單體均需按照特定的順序完成偶聯(lián)。具體參照如下步驟：首先利用2 mL的離心管盛裝固相CPG，向其注入1 mL濃氨水；其次為氨解過程，該過程溫度需控制在50 ℃以內(nèi)，順利實現(xiàn)固相切除；然后進行離心處理，為HPLC分離純化提供條件，離心力為1 000～13 000 r·min-1。本實驗液相純化DNA采用安捷倫反相C18制備柱，參照之前發(fā)表的液相色譜條件進行分離純化，最后取得目標(biāo)溶液做脫 DMT、沉降除鹽處理，最后進行ESI-MS質(zhì)譜鑒定，應(yīng)用的DNA為400 pmol。

1.4 偶氮苯修飾的DNA光異構(gòu)化

首先利用1×PBS溶解T7NC到T7NC3序列，配置溶液濃度為2.5 μmol/L；其次為退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃；然后進行紫外照射，容器為石英比色皿，照射條件為365 nm, 7 mW/cm2。按照20 s的時間間隔分別測定吸光度，共計測量時間為2 min。再采取白光燈照射，照射條件為>400 nm，11 W。紫外照射為反式到順式，白光燈照射為順式到反式，吸光度測量時間間隔均為20 s，分析軟件選用Origin 8.0。

1.5 修飾后的模板指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄

將模板鏈和非模板鏈(2∶1)均勻混合，與預(yù)配好的10×RNA Thermopol反應(yīng)溶液混合，溶液規(guī)格為2 μL；添加NTP，溶液規(guī)格為1 μL；進行退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃。退火結(jié)束后需要自然冷卻，設(shè)置兩組實驗，變量為紫外照射和不光照，前者的處理時間為5 min，為了實現(xiàn)后續(xù)的充分結(jié)合，進行10 min的孵育操作，孵育條件為無光照。完成上述處理后向體系內(nèi)加入50 U/μL T7 RNA聚合酶，在此基礎(chǔ)上進行渦旋振蕩處理，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的獲得，需經(jīng)歷2 h的孵育過程，溫度保持在37 ℃。將預(yù)配好的上樣緩沖液加入體系內(nèi)，二者為1∶1的體積比，充分混勻后繼續(xù)孵育，孵育時間為5 min，孵育溫度為90 ℃。預(yù)配好20%變性聚丙烯酰胺凝膠(內(nèi)含7 mol/L尿素)，樣品量為10 mL。接下來選擇1×TBE緩沖液進行聚丙烯凝膠電泳操作。跑完電泳后用SYBR gold染色，并進行成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 偶氮苯修飾轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計，合成及結(jié)構(gòu)鑒定

在本研究中，合成了偶氮苯修飾的非模板鏈(non-template)及模板鏈(template)，前期操作主要以常規(guī)T7模板轉(zhuǎn)錄序列為參考，目的在于深入分析偶氮苯修飾所起到的作用。在模板中引入T7啟動子序列和轉(zhuǎn)錄序列，主要目的在于滿足T7 RNA聚合酶高依賴性的要求。值得一提的是，T7 啟動子序列具備兩個功能區(qū)，RNAP識別區(qū)(-11～-7位點)和解旋區(qū)(-4～-1位點)，即結(jié)合位點以及解螺旋位點。具體參照圖1。

圖1 轉(zhuǎn)錄所用DNA模板和偶氮苯修飾的非模板DNA序列Fig.1 DNA template for transcription and non-template DNA sequence modified with azobenzene

將偶氮苯修飾在非模板鏈上，在T7 Promoter區(qū)通過偶氮苯引入保護短鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而紫外光照后的偶氮苯轉(zhuǎn)為順式，非模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，將影響DNA模板與T7 RNA聚合酶之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄活性?？紤]到保護鏈的長度可能影響其轉(zhuǎn)錄活性，因而末端保護鏈設(shè)計長度選擇了如下4個規(guī)格，分別為5、7、9、11 nt，分別對應(yīng)于T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3，見圖1。

按照前期研究建立的方法合成偶氮苯衍生物[32]，產(chǎn)物為4，4′-二羥甲基偶氮苯，其兩端羥基分別進行DMT保護反應(yīng)以及合成偶氮苯亞磷酰胺單體，從而可進一步連接在核酸鏈中。利用ABI 394 DNA合成儀進行偶氮苯修飾DNA合成，分別進行切除并脫保護以及HPLC分離操作。鑒定結(jié)果具體參照表1。

2.2 偶氮苯修飾的非模板DNA的光異構(gòu)化

將偶氮苯修飾的DNA(T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3)利用1×PBS溶解，溶液濃度為2.5 μmol/L，其次為退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃。

表1 偶氮苯修飾的非模板DNA的ESI-MS鑒定Table 1 ESI-MS identification of azobenzene modified non-template DNA

沒有光照時，偶氮苯-核酸的共軛體T7NC中偶氮苯呈現(xiàn)熱穩(wěn)定的反式形式，其紫外光譜在335 nm(π-π*)處呈現(xiàn)肩峰。分別進行紫外燈照射處理以及白光光照處理，得到圖2(a)和2(b)所示的峰圖。由圖可以觀察到，增色效應(yīng)較為顯著的波長為260 nm。由于DNA鏈長度增加，偶氮苯濃度相對減少，導(dǎo)致其紫外特征峰偏低，因而在335 nm處吸光度普遍偏低，而在430 nm(n-π*)處幾乎不可見。另外，還可以觀測到在上述兩個光照條件下，T7NC1、T7NC2和T7NC3均有類似峰變化趨勢，具體分別見圖2(c)、2(d)，圖2(e)、2(f)和圖2(g)、2(h)。可知，偶氮苯被修飾到寡核苷酸中，能起到光異構(gòu)化的作用。此外，偶氮苯修飾的DNA通過365 nm的紫外光照120 s即可達(dá)到主要含有順式結(jié)構(gòu)的光穩(wěn)態(tài)，而可見光照120 s它們將從順式返回原始的反式結(jié)構(gòu)。

2.3 偶氮苯修飾的非模板DNA光控的轉(zhuǎn)錄活性

T7 RNA聚合酶能夠催化rNTP的5′-磷酸基與下一個rNTP的3′-OH之間磷酸二酯鍵的建立，如此一來，便順利實現(xiàn)了新生RNA鏈的延伸。接下來，進一步探討T7 RNA聚合酶催化下偶氮苯修飾非模板DNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄的可行性，分別設(shè)置5、7、9、11 nt長度的保護鏈，通過上述保護鏈發(fā)揮調(diào)控作用。T7啟動子包括兩個功能區(qū)域，其中，-11～-7是T7 RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)域(圖1)。在酶結(jié)合區(qū)域的配對過程中，T7NC1、T7NC2和T7NC3這3個序列的保護鏈均發(fā)揮了重要作用。

圖3是模板鏈和非模板鏈(template，T7NC，T7NC1，T7NC2和T7NC3)1∶1混合后T7 RNA聚合酶催化15 min的結(jié)果。圖3(a)，1通道是正常的非模板鏈和模板鏈1∶1混合后，在T7 RNA聚合酶催化下RNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。2、4、6、8通道是T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3與模板鏈混合后沒有紫外光照時，在T7 RNA聚合酶催化下的結(jié)果，而3、5、7、9通道是T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3與模板鏈混合后紫外光照后酶催化下的結(jié)果。顯然，對于含T7NC的模板DNA幾乎沒有發(fā)生RNA轉(zhuǎn)錄(圖3(a)，2通道)，而光照后，有明顯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成(圖3(a)，3通道)。通過定量分析(圖3(b))，發(fā)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從光照前3.4%增加到光照后21.4%，大約有6.25倍的變化。同樣，對于含有T7NC1、T7NC2和T7NC3的 DNA模板，紫外光照后其指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也有所增加(圖3(a)，5通道對4通道，7通道對6通道，9通道對8通道)，增加的效率分別為4、3、1.25倍。因此，非模板鏈上通過偶氮苯連接5個堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與模板鏈組合指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄具有最佳的光控效果。這是因為光照前反式偶氮苯使得非模板鏈上保護鏈與其結(jié)合力很強，阻礙了非模板鏈與模板鏈的結(jié)合，從而影響T7 RNA聚合酶與模板DNA的結(jié)合，所以影響了RNA轉(zhuǎn)錄活性。而紫外光照后，形成的順式偶氮苯使得非模板鏈上發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱，非模板鏈利于與模板鏈結(jié)合，有利于T7 RNA聚合酶的結(jié)合，從而恢復(fù)RNA轉(zhuǎn)錄活性。值得注意的是，隨著非模板鏈上保護鏈的長度增加(T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3)，光照前后RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加的程度減小，這可能由于非模板上保護鏈的長度越長，往往對應(yīng)著更高的發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且該穩(wěn)定性不會在光照條件下改變，也就不會引起T7 RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合的改變。與Liu等[33]報道的模板側(cè)鏈引入偶氮苯單元控制RNA轉(zhuǎn)錄活性比較，本文通過單一偶氮苯修飾在T7啟動子末端，紫外光照引發(fā)更有效地調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄活性，而他們通過多個偶氮苯修飾提高調(diào)控效率，但也將不可避免地需要長時間的紫外光照。

對于偶氮苯修飾的模板與正常的轉(zhuǎn)錄模板的轉(zhuǎn)錄過程，隨時間變化進行分析。發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也將增多。如圖4，反應(yīng)時間為30 min時，含T7NC序列的DNA模板對RNA轉(zhuǎn)錄仍然表現(xiàn)出一定的光控制能力，光照前后差異達(dá)到1.56倍。含T7NC1序列的DNA模板對RNA轉(zhuǎn)錄在光照后增加為1.15倍。而對于含T7NC2和T7NC3序列的DNA模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物光照前后幾乎無明顯差異。

圖4 偶氮苯修飾非模板鏈(N-Tem)和模板形成的雙鏈在 T7 RNA聚合酶催化30 min后RNA轉(zhuǎn)錄的變性膠分析Fig.4 Denatured gel analysis of azo-modified non-template strands (N-Tem) and template-derived double strands after 30 min of T7 RNA polymerase catalyzed RNA transcription

當(dāng)酶催化反應(yīng)時間延長為45 min時，會出現(xiàn)圖5所示的結(jié)果，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率大致相同。紫外光照前后轉(zhuǎn)錄效果沒有明顯變化，可能是隨著時間的推移，偶氮苯異構(gòu)化會導(dǎo)致模板DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，在此結(jié)構(gòu)打開的過程中順利實現(xiàn)了模板的插入。如此一來，啟動子序列會被釋放，進而轉(zhuǎn)向連續(xù)延伸模式。轉(zhuǎn)錄活動能夠在上述條件下正常進行，主要原因在于模板配對的氫鍵作用不會受到偶氮苯保護鏈結(jié)構(gòu)的決定性影響。

圖5 偶氮苯修飾非模板鏈(N-Tem)和模板形成的雙鏈在 T7 RNA聚合酶催化45 min后RNA轉(zhuǎn)錄的變性膠分析Fig.5 Denatured gel analysis of azo-modified non-template strands (N-Tem) and template-derived double strands after 45 min of T7 RNA polymerase catalyzed RNA transcription

對與偶氮苯修飾的DNA模板指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄的時間變化研究表明，RNA轉(zhuǎn)錄活性光調(diào)控效果主要歸結(jié)于催化效率的調(diào)控，這也與文獻(xiàn)[30-34]報道的結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

在本研究中，主要針對偶氮苯單元修飾在DNA模板上對RNA轉(zhuǎn)錄的光控制行為進行系統(tǒng)而深入的探討，首先進行保護鏈的篩選，即5、7、9、11個堿基，然后與DNA模板相連接，進行兩個不同光照條件的對比，探究其轉(zhuǎn)錄效率的變化趨勢。研究顯示，光控轉(zhuǎn)錄效果最好的一組模板為含T7NC序列DNA模板。但是隨著時間的延長，光控效果明顯減弱，說明T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄機理限制時間上的調(diào)控。