偶氮苯修飾的發(fā)夾DNA對RNA轉(zhuǎn)錄的光調(diào)控*

陳露，季禾茗，莫蒙武，雷華軍，卜新雅，何裕建，封祿田?，吳麗?

(1 沈陽化工大學應用化學學院， 沈陽 110142； 2 中國科學院大學化學科學學院， 北京 100049； 3 廣東工業(yè)大學材料與能源學院， 廣州 510006)

近年來，生物功能的人工控制因在細胞生物學、藥理學和生物納米技術中的廣泛應用而受到關注。在基因表達的人工控制方面，人們通常應用光、熱、電場和pH等各種外界刺激來實現(xiàn)。光由于非入侵的方式、時間和空間上的高分辨及無污染等特點在生物應用中有著空前的優(yōu)勢。近年來，光已經(jīng)被廣泛地應用到研究化學生物學、生命科學和醫(yī)學等各個領域, 尤其是利用光敏感核酸作為新的研究工具調(diào)控基因的功能, 極大地促進了基因功能分子學研究的發(fā)展，為后續(xù)的基因表達網(wǎng)絡的構(gòu)建奠定基礎。

近年來，偶氮苯憑借著化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、光照后迅速發(fā)生異構(gòu)化等特點，成為光異構(gòu)化分子的典型代表之一[1-2]。以反式構(gòu)型(trans)為母體，由于該結(jié)構(gòu)趨于平面結(jié)構(gòu)，因此其熱力學性質(zhì)較其他結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，與此同時，在分別施加可見光(>400 nm)以及紫外光(UV<366 nm)的刺激后，前者能夠順利由順式構(gòu)型(cis)變化為trans構(gòu)型，后者則能夠轉(zhuǎn)變?yōu)閏is構(gòu)型，其具備的基本特征為穩(wěn)定性較低[3-5]。受上述特征的影響，偶氮苯類化合物得到廣泛應用，在多個領域均發(fā)揮出重要作用[6-10]。

將偶氮苯引入到核酸分子中, 從時間和空間上調(diào)控生物化學、醫(yī)學和生理體系方面也引起了科研工作者的廣泛興趣及重點關注。因此，這提供了一條可行性較高的核酸結(jié)構(gòu)改造途徑，即插入光響應分子實現(xiàn)核酸結(jié)構(gòu)及其性能的改變，如引入到核糖體、核酸骨架等位置。通過上述方式改造核酸，進而實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄、核糖核酸酶的有效控制等[11-25]。另外，Tsai等[26]通過光-生物正交配體束縛在時空上控制蛋白質(zhì)活性的光學切換，利用光快速調(diào)節(jié)活哺乳動物細胞中蛋白質(zhì)功能的選擇性。Reis等[27]使用可見光實現(xiàn)基于人組蛋白脫乙酰基酶光致變色抑制劑的表觀遺傳機制的高分辨率，設計一種表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)錄的化學光學調(diào)制探針，可以轉(zhuǎn)化為需要有條件和選擇性表觀基因組調(diào)節(jié)的疾病的新治療策略。Kamiya等[28]使用的光響應性T7啟動子和偶氮苯衍生物的化學結(jié)構(gòu)將光開關分子插入T7啟動子中的指定位置，在具有可見光的無細胞翻譯系統(tǒng)中實現(xiàn)綠色熒光蛋白產(chǎn)生的有效光調(diào)節(jié)。Bian等[29]設計一種新型可重復使用的環(huán)糊精修飾表面，利用環(huán)糊精和偶氮苯之間的主客體相互作用實現(xiàn)光交換特定細胞釋放。

我們針對本研究進行積極的前期探索，并取得了一定成績，目前已順利實現(xiàn)4，4′-二羥甲基偶氮苯的發(fā)夾DNA開關的合成。該研究表明，發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性會在4，4′-二羥甲基偶氮苯的光異構(gòu)化的作用下發(fā)生變化，在這一過程中需要對反應溫度進行控制(Δtm=24 ℃)[30-31]，另外，上述操作同樣能夠影響RNase H酶作用的降解，主要通過將其引入反義核酸兩端來實現(xiàn)。此外，還研究了DNA引物延伸相關的聚合酶鏈反應的光調(diào)控。在這一過程中，需要重點關注一個因素，即穩(wěn)定雙鏈是否能夠形成。因此，需要插入保護鏈，形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，確保不發(fā)生引物延伸現(xiàn)象。通過紫外光照處理，可以脫去DNA模板的保護鏈，為后續(xù)引物結(jié)合操作創(chuàng)造條件，確保引物延伸能夠順利實現(xiàn)[32]。通過上述實驗操作保證實驗結(jié)果的準確性與可重復性。

本文提出對生命活動過程中核酸轉(zhuǎn)錄進行光調(diào)控，通過對DNA雙鏈的非模板鏈進行偶氮苯修飾，研究T7 RNA聚合酶催化下其指導的RNA轉(zhuǎn)錄反應的光調(diào)控可行性。參考常規(guī)含T7啟動子DNA模板研究RNA的轉(zhuǎn)錄，將偶氮苯引入非模板鏈的啟動子區(qū)域末端，然后分別連接5、7、9、11 nt的4種長度保護鏈。根據(jù)我們以前的研究，反式的偶氮苯使得非模板鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而紫外光照后的順式偶氮苯打破非模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。我們希望通過順反異構(gòu)化改變偶氮苯周圍的DNA雙鏈體的局部結(jié)構(gòu)，影響DNA與酶之間的相互作用，從而光調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄。此外，還通過改變在啟動子末端的保護鏈的長度詳細研究光調(diào)節(jié)效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較短長度修飾的偶氮苯保護鏈啟動子可以實現(xiàn)明確的光調(diào)節(jié)，進一步解釋了DNA模板雙鏈體的解離或雙鏈體的局部結(jié)構(gòu)影響光調(diào)節(jié)的機制。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

選用分析純試劑藥品。實驗所用常規(guī)藥品均購自于北京化工廠，主要有：石油醚(PE)、三乙胺(TEA)、無水硫酸鈉(Na2SO4)、乙酸乙酯(EA)、氯化鈉(NaCl)、200～300目硅膠、氫氧化鈉(NaOH)；自蕪湖華仁科技有限公司購入二氯甲烷(DCM)、乙腈(C2H3N)、四氫呋喃(THF)等，主要用于無水反應，以及標準脫氧核苷亞磷酰胺單體用于DNA合成；自生工科技有限公司購入轉(zhuǎn)錄試劑、引物等分子試劑；自Thermo Fisher購入SYBR gold核酸染色劑；自寶如億科技有限公司購入T7 RNA 聚合酶。

1.2 主要儀器與設備

主要應用到的儀器與設備有：1260高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫)、400 M核磁共振儀(AVANCE)、ChemiDoc XRS 高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)、DNA 合成儀(AppliedBiosystems)、UV1800 紫外分光光度計(島津)。

1.3 偶氮苯衍生物修飾 DNA 的固相合成與純化

首先向合成柱中裝入Universal-CPG，裝入量為35 mg左右，即1 μmol，主要以CPG載體為依據(jù)。然后從5′到3′編輯目標寡聚核苷酸序列，主要依據(jù)為雅磷酰胺單體的裝載位置規(guī)律。將DNA核苷亞磷酰胺單體由3′端向5′端向固相CPG的連接，均采取常規(guī)合成方法，具體參照相關操作手冊，在這一過程中使用的設備為ABI 394DNA/RNA固相合成儀。最后，想要順利得到目標序列的固相，需要實現(xiàn)在CPG的寡聚核酸上亞磷酰胺單體的偶聯(lián)，每個單體均需按照特定的順序完成偶聯(lián)。具體參照如下步驟：首先利用2 mL的離心管盛裝固相CPG，向其注入1 mL濃氨水；其次為氨解過程，該過程溫度需控制在50 ℃以內(nèi)，順利實現(xiàn)固相切除；然后進行離心處理，為HPLC分離純化提供條件，離心力為1 000～13 000 r·min-1。本實驗液相純化DNA采用安捷倫反相C18制備柱，參照之前發(fā)表的液相色譜條件進行分離純化，最后取得目標溶液做脫 DMT、沉降除鹽處理，最后進行ESI-MS質(zhì)譜鑒定，應用的DNA為400 pmol。

1.4 偶氮苯修飾的DNA光異構(gòu)化

首先利用1×PBS溶解T7NC到T7NC3序列，配置溶液濃度為2.5 μmol/L；其次為退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃；然后進行紫外照射，容器為石英比色皿，照射條件為365 nm, 7 mW/cm2。按照20 s的時間間隔分別測定吸光度，共計測量時間為2 min。再采取白光燈照射，照射條件為>400 nm，11 W。紫外照射為反式到順式，白光燈照射為順式到反式，吸光度測量時間間隔均為20 s，分析軟件選用Origin 8.0。

1.5 修飾后的模板指導的轉(zhuǎn)錄

將模板鏈和非模板鏈(2∶1)均勻混合，與預配好的10×RNA Thermopol反應溶液混合，溶液規(guī)格為2 μL；添加NTP，溶液規(guī)格為1 μL；進行退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃。退火結(jié)束后需要自然冷卻，設置兩組實驗，變量為紫外照射和不光照，前者的處理時間為5 min，為了實現(xiàn)后續(xù)的充分結(jié)合，進行10 min的孵育操作，孵育條件為無光照。完成上述處理后向體系內(nèi)加入50 U/μL T7 RNA聚合酶，在此基礎上進行渦旋振蕩處理，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的獲得，需經(jīng)歷2 h的孵育過程，溫度保持在37 ℃。將預配好的上樣緩沖液加入體系內(nèi)，二者為1∶1的體積比，充分混勻后繼續(xù)孵育，孵育時間為5 min，孵育溫度為90 ℃。預配好20%變性聚丙烯酰胺凝膠(內(nèi)含7 mol/L尿素)，樣品量為10 mL。接下來選擇1×TBE緩沖液進行聚丙烯凝膠電泳操作。跑完電泳后用SYBR gold染色，并進行成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 偶氮苯修飾轉(zhuǎn)錄模板的設計，合成及結(jié)構(gòu)鑒定

在本研究中，合成了偶氮苯修飾的非模板鏈(non-template)及模板鏈(template)，前期操作主要以常規(guī)T7模板轉(zhuǎn)錄序列為參考，目的在于深入分析偶氮苯修飾所起到的作用。在模板中引入T7啟動子序列和轉(zhuǎn)錄序列，主要目的在于滿足T7 RNA聚合酶高依賴性的要求。值得一提的是，T7 啟動子序列具備兩個功能區(qū)，RNAP識別區(qū)(-11～-7位點)和解旋區(qū)(-4～-1位點)，即結(jié)合位點以及解螺旋位點。具體參照圖1。

圖1 轉(zhuǎn)錄所用DNA模板和偶氮苯修飾的非模板DNA序列Fig.1 DNA template for transcription and non-template DNA sequence modified with azobenzene

將偶氮苯修飾在非模板鏈上，在T7 Promoter區(qū)通過偶氮苯引入保護短鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而紫外光照后的偶氮苯轉(zhuǎn)為順式，非模板的發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，將影響DNA模板與T7 RNA聚合酶之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄活性?？紤]到保護鏈的長度可能影響其轉(zhuǎn)錄活性，因而末端保護鏈設計長度選擇了如下4個規(guī)格，分別為5、7、9、11 nt，分別對應于T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3，見圖1。

按照前期研究建立的方法合成偶氮苯衍生物[32]，產(chǎn)物為4，4′-二羥甲基偶氮苯，其兩端羥基分別進行DMT保護反應以及合成偶氮苯亞磷酰胺單體，從而可進一步連接在核酸鏈中。利用ABI 394 DNA合成儀進行偶氮苯修飾DNA合成，分別進行切除并脫保護以及HPLC分離操作。鑒定結(jié)果具體參照表1。

2.2 偶氮苯修飾的非模板DNA的光異構(gòu)化

將偶氮苯修飾的DNA(T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3)利用1×PBS溶解，溶液濃度為2.5 μmol/L，其次為退火處理，時間為5 min，溫度為95 ℃。

表1 偶氮苯修飾的非模板DNA的ESI-MS鑒定Table 1 ESI-MS identification of azobenzene modified non-template DNA

沒有光照時，偶氮苯-核酸的共軛體T7NC中偶氮苯呈現(xiàn)熱穩(wěn)定的反式形式，其紫外光譜在335 nm(π-π*)處呈現(xiàn)肩峰。分別進行紫外燈照射處理以及白光光照處理，得到圖2(a)和2(b)所示的峰圖。由圖可以觀察到，增色效應較為顯著的波長為260 nm。由于DNA鏈長度增加，偶氮苯濃度相對減少，導致其紫外特征峰偏低，因而在335 nm處吸光度普遍偏低，而在430 nm(n-π*)處幾乎不可見。另外，還可以觀測到在上述兩個光照條件下，T7NC1、T7NC2和T7NC3均有類似峰變化趨勢，具體分別見圖2(c)、2(d)，圖2(e)、2(f)和圖2(g)、2(h)?？芍嫉奖恍揎椀焦押塑账嶂?，能起到光異構(gòu)化的作用。此外，偶氮苯修飾的DNA通過365 nm的紫外光照120 s即可達到主要含有順式結(jié)構(gòu)的光穩(wěn)態(tài)，而可見光照120 s它們將從順式返回原始的反式結(jié)構(gòu)。

2.3 偶氮苯修飾的非模板DNA光控的轉(zhuǎn)錄活性

T7 RNA聚合酶能夠催化rNTP的5′-磷酸基與下一個rNTP的3′-OH之間磷酸二酯鍵的建立，如此一來，便順利實現(xiàn)了新生RNA鏈的延伸。接下來，進一步探討T7 RNA聚合酶催化下偶氮苯修飾非模板DNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄的可行性，分別設置5、7、9、11 nt長度的保護鏈，通過上述保護鏈發(fā)揮調(diào)控作用。T7啟動子包括兩個功能區(qū)域，其中，-11～-7是T7 RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)域(圖1)。在酶結(jié)合區(qū)域的配對過程中，T7NC1、T7NC2和T7NC3這3個序列的保護鏈均發(fā)揮了重要作用。

圖3是模板鏈和非模板鏈(template，T7NC，T7NC1，T7NC2和T7NC3)1∶1混合后T7 RNA聚合酶催化15 min的結(jié)果。圖3(a)，1通道是正常的非模板鏈和模板鏈1∶1混合后，在T7 RNA聚合酶催化下RNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。2、4、6、8通道是T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3與模板鏈混合后沒有紫外光照時，在T7 RNA聚合酶催化下的結(jié)果，而3、5、7、9通道是T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3與模板鏈混合后紫外光照后酶催化下的結(jié)果。顯然，對于含T7NC的模板DNA幾乎沒有發(fā)生RNA轉(zhuǎn)錄(圖3(a)，2通道)，而光照后，有明顯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成(圖3(a)，3通道)。通過定量分析(圖3(b))，發(fā)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從光照前3.4%增加到光照后21.4%，大約有6.25倍的變化。同樣，對于含有T7NC1、T7NC2和T7NC3的 DNA模板，紫外光照后其指導的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也有所增加(圖3(a)，5通道對4通道，7通道對6通道，9通道對8通道)，增加的效率分別為4、3、1.25倍。因此，非模板鏈上通過偶氮苯連接5個堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與模板鏈組合指導的RNA轉(zhuǎn)錄具有最佳的光控效果。這是因為光照前反式偶氮苯使得非模板鏈上保護鏈與其結(jié)合力很強，阻礙了非模板鏈與模板鏈的結(jié)合，從而影響T7 RNA聚合酶與模板DNA的結(jié)合，所以影響了RNA轉(zhuǎn)錄活性。而紫外光照后，形成的順式偶氮苯使得非模板鏈上發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱，非模板鏈利于與模板鏈結(jié)合，有利于T7 RNA聚合酶的結(jié)合，從而恢復RNA轉(zhuǎn)錄活性。值得注意的是，隨著非模板鏈上保護鏈的長度增加(T7NC、T7NC1、T7NC2和T7NC3)，光照前后RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加的程度減小，這可能由于非模板上保護鏈的長度越長，往往對應著更高的發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且該穩(wěn)定性不會在光照條件下改變，也就不會引起T7 RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合的改變。與Liu等[33]報道的模板側(cè)鏈引入偶氮苯單元控制RNA轉(zhuǎn)錄活性比較，本文通過單一偶氮苯修飾在T7啟動子末端，紫外光照引發(fā)更有效地調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄活性，而他們通過多個偶氮苯修飾提高調(diào)控效率，但也將不可避免地需要長時間的紫外光照。

對于偶氮苯修飾的模板與正常的轉(zhuǎn)錄模板的轉(zhuǎn)錄過程，隨時間變化進行分析。發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也將增多。如圖4，反應時間為30 min時，含T7NC序列的DNA模板對RNA轉(zhuǎn)錄仍然表現(xiàn)出一定的光控制能力，光照前后差異達到1.56倍。含T7NC1序列的DNA模板對RNA轉(zhuǎn)錄在光照后增加為1.15倍。而對于含T7NC2和T7NC3序列的DNA模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物光照前后幾乎無明顯差異。

圖4 偶氮苯修飾非模板鏈(N-Tem)和模板形成的雙鏈在 T7 RNA聚合酶催化30 min后RNA轉(zhuǎn)錄的變性膠分析Fig.4 Denatured gel analysis of azo-modified non-template strands (N-Tem) and template-derived double strands after 30 min of T7 RNA polymerase catalyzed RNA transcription

當酶催化反應時間延長為45 min時，會出現(xiàn)圖5所示的結(jié)果，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率大致相同。紫外光照前后轉(zhuǎn)錄效果沒有明顯變化，可能是隨著時間的推移，偶氮苯異構(gòu)化會導致模板DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，在此結(jié)構(gòu)打開的過程中順利實現(xiàn)了模板的插入。如此一來，啟動子序列會被釋放，進而轉(zhuǎn)向連續(xù)延伸模式。轉(zhuǎn)錄活動能夠在上述條件下正常進行，主要原因在于模板配對的氫鍵作用不會受到偶氮苯保護鏈結(jié)構(gòu)的決定性影響。

圖5 偶氮苯修飾非模板鏈(N-Tem)和模板形成的雙鏈在 T7 RNA聚合酶催化45 min后RNA轉(zhuǎn)錄的變性膠分析Fig.5 Denatured gel analysis of azo-modified non-template strands (N-Tem) and template-derived double strands after 45 min of T7 RNA polymerase catalyzed RNA transcription

對與偶氮苯修飾的DNA模板指導的RNA轉(zhuǎn)錄的時間變化研究表明，RNA轉(zhuǎn)錄活性光調(diào)控效果主要歸結(jié)于催化效率的調(diào)控，這也與文獻[30-34]報道的結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

在本研究中，主要針對偶氮苯單元修飾在DNA模板上對RNA轉(zhuǎn)錄的光控制行為進行系統(tǒng)而深入的探討，首先進行保護鏈的篩選，即5、7、9、11個堿基，然后與DNA模板相連接，進行兩個不同光照條件的對比，探究其轉(zhuǎn)錄效率的變化趨勢。研究顯示，光控轉(zhuǎn)錄效果最好的一組模板為含T7NC序列DNA模板。但是隨著時間的延長，光控效果明顯減弱，說明T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄機理限制時間上的調(diào)控。