海南地區(qū)油茶未成熟胚分生結(jié)節(jié)的植株再生

侯辛辛 陳健妙 高興 賴杭桂 王健 胡新文 吳友根

摘要：【目的】建立海南地區(qū)油茶未成熟胚再生體系，為油茶組培快繁和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳院Ｄ媳镜赜筒韬献优邽橥庵搀w，對(duì)其進(jìn)行初代誘導(dǎo)、分化和增殖培養(yǎng)，篩選出最適于誘導(dǎo)分化的外植體胚發(fā)育時(shí)期，明確植株再生途徑，從而建立分生結(jié)節(jié)組織植株再生體系?！窘Y(jié)果】（1）盛花期后240～300 d的油茶幼胚在改良MS+激動(dòng)素（KT）2.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.2 mg/L+玉米素（ZT）5.0 mg/L培養(yǎng)基上，初代誘導(dǎo)率在90.0%以上，以分生結(jié)節(jié)組織為主;（2）分生結(jié)節(jié)組織的適宜增殖培養(yǎng)基為改良MS+KT 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)約4.6;（3）未成熟胚分生結(jié)節(jié)組織的分化培養(yǎng)基為改良MS+6-芐氨基嘌呤（6-BA）2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+吲哚-3-乙酸（IAA）0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+酸水解酪蛋白（CH）400.0 mg/L，平均每塊分生結(jié)節(jié)組織誘導(dǎo)不定芽11.3個(gè)，不定芽以無糖暴露培養(yǎng)生根方式生根，移栽成活率為91.6%;（4）分生結(jié)節(jié)組織在改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+CH 400.0 mg/L上以分化體細(xì)胞胚狀體為主，每塊分生結(jié)節(jié)分化6.5個(gè)體細(xì)胞胚狀體，具雙子葉的體細(xì)胞胚狀體在改良MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+赤霉酸（GA3）0.5 mg/L+CH 200.0 mg/L培養(yǎng)基上有效成熟和萌發(fā)，萌發(fā)率為72.1%，胚芽和胚根有效伸長形成體胚再生植株，移栽成活率為94.7%?！窘Y(jié)論】以油茶未成熟合子胚為外植體，通過分生結(jié)節(jié)組織方式增殖，可經(jīng)體細(xì)胞胚狀體發(fā)生和不定芽發(fā)生兩種途徑成功建立海南油茶未成熟胚分生結(jié)節(jié)植株再生體系。

關(guān)鍵詞： 油茶;未成熟胚;分生結(jié)節(jié)組織;不定芽;體細(xì)胞胚狀體;海南

Abstract：【Objective】To establish immature zygotic embryos regeneration system of Camellia vietnamensis， which provided technical support for the research on rapid propagation and genetic transformation of C.vietnamensis. 【Method】 Hainan native C. vietnamensis zygotic embryos were used as explants， zygotic embryos were induced to differentiate and proliferate to select the most suitable stage for inducing differentiation. Meanwhile， and the proliferation and plant regene-ration pathways were determined， so as to establish the regeneration system of meristematic nodules induced from immature zygotic embryos of C. vietnamensis. 【Result】（1）When the immature embryo at 240-300 d after full flowering stage cultured at the modified MS+kinetin（KT）2.0 mg/L+naphthaleneacetic acid（NAA） 0.2 mg/L+zeatin（ZT）5.0 mg/L me-dium， the initial induction rate of the immature embryo was more than 90.0% and the meristematic nodules were majority. （2）The suitable medium for the proliferation of meristematic nodule tissues was the modified MS+1.0-2.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA， and the proliferation coefficient was approximately 4.6. （3）The differentiation medium for immature embryo meristematic nodules was modified MS + 2.0 mg/L 6-benzyl adenine（6-BA）+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L indole-3-acetic acid（IAA）+ZT 5.0 mg/L and the average adventitious bud number was 11.3. Adventitious shoots rooted by sugar-free exposed cultivation， and plant transplant survival rate was 91.6%. （4）The meristematic nodule cultured at the modified MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ZT 5.0 mg/L mainly differentiated into somatic embryo with the average somatic embryo number of 6.5. Somatic embryos with dicotyledonate were effectively germinated and developed into plantlets on modified MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IAA+0.5 mg/L gibberellic acid（GA3）+CH 200.0 mg/L medium. The germination rate was 72.1%， the germ and the radicle were effectively extended to form a somatic embryo regeneration plant and plant transplant survival rate was 94.7%. 【Conclusion】With the immature zygotic embryos as explants，? two regeneration systems of meristematic nodules in Hainan native C. vietnamensis are established through somatic embryogenesis and bud generation pathways respectively after proliferation of meristematic nodules.

0 引言

【研究意義】油茶（Camellia oleifera）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物中油脂含量較高的植物總稱，生長在我國南方地區(qū)的高山及丘陵地帶，是我國特有的一種純天然高級(jí)油料，與橄欖、油棕和椰子并稱為世界四大木本油料植物（莊瑞林，2008;楊枝林等，2017;龔洪恩等，2019）。海南省油茶資源豐富，栽培歷史悠久，但其科研及產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)滯后，尚未被列入國家發(fā)布的《全國油茶發(fā)展規(guī)劃（2009—2020年）》，一定程度上限制了海南油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（鄭道君等，2016）。當(dāng)前，制約海南油茶優(yōu)良品種推廣種植、產(chǎn)業(yè)健康平穩(wěn)發(fā)展的關(guān)鍵因素是缺乏本土油茶良種種苗，因此，亟待建立高效、穩(wěn)定的海南本土油茶植株再生體系，為海南本地油茶良種壯苗繁育及品種遺傳改良等提供技術(shù)保障?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外針對(duì)油茶的研究從未停止，但各有側(cè)重。國外的研究主要集中在茶皂素、皂苷及茶油抗氧化活性等領(lǐng)域（周增亮等，2019），也有針對(duì)油茶副產(chǎn)品的研發(fā)，如油茶果殼的循環(huán)利用等（Xie et al.，2018）。國內(nèi)則更重視對(duì)不同產(chǎn)地油茶的種植和嫁接育苗技術(shù)，有關(guān)油茶組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化的研究相對(duì)薄弱（Song et al.，2014;Yu et al.，2018）。組織培養(yǎng)是油茶離體保存、良種快繁及遺傳改良等的技術(shù)保障，對(duì)促進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義（周開兵等，2016;周廣振等，2018）。當(dāng)前，我國用于造林的油茶物種主要有中果（普通）油茶（C. oleifera Abel.）、小果油茶（C. meiocarpa Hu.）和大果（越南、高州和陸川）油茶（C. vietnamensis T. C. Huang ex Hu）等（姚小華，2016）。中果油茶是我國油茶的主栽物種，以不同外植體建立的植株再生體系已有報(bào)道，如湘林、岑軟及三華（華碩、華金和華鑫）等系列油茶，主要以頂芽、含腋芽莖段或子葉為外植體，通過器官發(fā)生途徑形成再生植株，但不同品種或同一品種不同生長期所用基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑種類與配比等存在明顯差異（張智俊等，2005;王以紅等，2011;李澤等，2014）。華鑫和長林等系列油茶是以幼胚為外植體，通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成再生植株（范曉明等，2011;胡玉玲等，2014）。其中，華鑫油茶以10月果實(shí)的合子胚子葉為外植體，胚性愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+6-芐氨基嘌呤（6-BA）1.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為76.67%，胚狀體最適分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L;以長林4號(hào)、長林53號(hào)和長林166號(hào)的合子胚為外植體，不同品種間的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚植株再生頻率差異顯著，影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)和體胚植株再生的關(guān)鍵因素依次為植物生長調(diào)節(jié)劑、胚齡和基本培養(yǎng)基;長林53號(hào)以7月幼果的合子胚為外植體，胚性愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0.5 mg/L+激動(dòng)素（KT）0.5 mg/L+噻苯?。═DZ）0.05 mg/L+甘氨酸（Gly）500 mg/L，誘導(dǎo)率為89.64%，胚狀體萌發(fā)和組培苗生長最佳配方為MS+吲哚-3-乙酸（IAA）2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+酸水解酪蛋白（CH）500 mg/L。綜上所述，以不同品種或同一品種不同外植體建立植株再生體系所需的基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑種類與配比及培養(yǎng)條件存在明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】越南油茶是海南地區(qū)的油茶主栽物種，已適應(yīng)熱帶季風(fēng)海洋性氣候并形成特殊的地理油茶小種——山柚（袁軍等，2014），但有關(guān)其組織培養(yǎng)的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討海南油茶的分生結(jié)節(jié)發(fā)生和植株再生過程及其影響因素，建立未成熟胚分生結(jié)節(jié)的植株再生體系，為油茶組培快繁和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為海南省瓊海市會(huì)山鎮(zhèn)中酒村油茶優(yōu)株——油茶王，以盛花期后4個(gè)不同時(shí)期（表1）的油茶果實(shí)合子胚（圖1）為外植體。采集的果實(shí)立即用冰盒保鮮并帶回實(shí)驗(yàn)室，避免果實(shí)水分散失，保持活性。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體消毒 在超凈工作臺(tái)上，用70%酒精浸泡油茶果實(shí)1 min，無菌水沖洗1遍，然后以0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗5遍。解剖刀切開果實(shí)，切取幼嫩種子及幼胚，接種在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，每天光照14 h，光照強(qiáng)度1500～2000 lx，空氣相對(duì)濕度（70±5）%。

1. 2. 2 合子胚發(fā)育時(shí)期篩選 將4個(gè)不同生長時(shí)期（幼果、小青果、中青果和大黃褐果）未成熟胚接種于預(yù)試驗(yàn)篩選出的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。幼果以幼嫩種子為外植體;小青果、中青果和大黃褐果切掉大部分子葉后，余下子葉與胚芽、胚軸和胚根一起作為外植體。每種外植體接種20個(gè)，3次重復(fù)。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率及誘導(dǎo)生長情況，再過15 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果，篩選出適宜的合子胚發(fā)育時(shí)期。誘導(dǎo)成效以誘導(dǎo)率（%）和誘導(dǎo)分化結(jié)果類型進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中，誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出新組織或器官的外植體數(shù)目（包含誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、分生結(jié)節(jié)組織及體細(xì)胞胚狀體等）/接種外植體總數(shù)×100;誘導(dǎo)分化結(jié)果分為4種類型：I為愈傷組織，II為分生結(jié)節(jié)組織，III為不定芽，IV為合子胚萌發(fā)。初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加KT 2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L和玉米素（ZT）5.0 mg/L，并添加椰汁（CW）5%、蔗糖30.0 g/L、植物凝膠2.2 g/L，pH 5.5。其中，改良MS為將MS培養(yǎng)基中大量元素含量減至2/3，并將有機(jī)成份改成B5（甘博格，Gamborg）培養(yǎng)基中的有機(jī)成份。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，空氣相對(duì)濕度（70±5）%，自然散射光照培養(yǎng)。

1. 2. 3 分生結(jié)節(jié)組織增殖 將中青果合子胚誘導(dǎo)出的分生結(jié)節(jié)組織，以單粒結(jié)節(jié)組織、2～3粒結(jié)節(jié)連塊或大粒切片的形式接種在添加不同種類、濃度和配比植物生長調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基上，篩選出適宜的分生結(jié)節(jié)組織增殖培養(yǎng)基。分生結(jié)節(jié)組織的增殖效果以增殖系數(shù)和結(jié)節(jié)組織生長情況為考核指標(biāo)。增殖培養(yǎng)基以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度和配比的細(xì)胞分裂素（KT和6-BA）及一定濃度的生長素（NAA）、CW 10%、蔗糖30.0 g/L、植物凝膠2.2 g/L，pH 5.5。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，空氣相對(duì)濕度（70±5）%，自然散射光照培養(yǎng)。25 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況，增殖系數(shù)=分生結(jié)節(jié)總個(gè)數(shù)/原接種分生結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)。

1. 2. 4 分生結(jié)節(jié)組織再分化 將增殖到一定量的分生結(jié)節(jié)組織以小單粒（直徑≤5.0 mm）、2～3個(gè)叢生結(jié)節(jié)組織或大粒切片（長5.0 mm×寬5.0 mm×厚1.0 mm）的形式轉(zhuǎn)接至再分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種5塊。每25 d繼代轉(zhuǎn)接一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)60 d后，可觀察到分生結(jié)節(jié)組織塊再分化出不定芽和體細(xì)胞胚狀體。再分化效果以分化率（%）、不定芽數(shù)/塊和子葉形體細(xì)胞胚狀體數(shù)/塊進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其中，總分化率（%）=再分化出體細(xì)胞胚狀體或不定芽的分生結(jié)節(jié)塊數(shù)/接種分生結(jié)節(jié)總塊數(shù)×100;不定芽分化率（%）=分化出不定芽為主的結(jié)節(jié)塊數(shù)/接種分生結(jié)節(jié)總塊數(shù)×100;體細(xì)胞胚狀體分化率（%）=總分化率（%）-不定芽分化率（%）;不定芽數(shù)/塊=誘導(dǎo)再分化不定芽總數(shù)/接種分生結(jié)節(jié)塊數(shù);體細(xì)胞胚狀體數(shù)/塊=再分化子葉形體細(xì)胞胚狀體數(shù)/接種分生結(jié)節(jié)塊數(shù)。每處理3次重復(fù)。分生結(jié)節(jié)再分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基以改良MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度和配比的細(xì)胞分裂素（KT、6-BA和ZT）、生長素（NAA和IAA）、CW 10%、CH 400.0 mg/L、蔗糖50.0 g/L、活性炭0.1%及植物凝膠2.2 g/L，pH 5.5。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，空氣相對(duì)濕度（70±5）%，自然散射光照培養(yǎng)。

1. 2. 5 分生結(jié)節(jié)組培芽生根和植株再生 待分生結(jié)節(jié)組織上的再分化芽長至3.0～4.0 cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將單個(gè)小芽從叢芽基部切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，共進(jìn)行8個(gè)處理（表2）。

生根基本培養(yǎng)基為1/2改良MS（大量元素含量減半，但KH2PO4依然維持170.0 mg/L），根據(jù)各處理要求添加植物生長調(diào)節(jié)劑[吲哚丁酸（IBA）和NAA]，其中①～⑥處理添加活性炭0.1%，蔗糖30.0 g/L，植物凝膠2.3 g/L，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min;⑦和⑧處理不添加蔗糖、活性炭和植物凝膠，pH 5.5，用滅菌液體培養(yǎng)基將蛭石拌勻至不滴水，分裝到12孔帶蓋育苗盒中，待接種用。常規(guī)組培生根每瓶接種10株，培養(yǎng)溫度（25±2）℃;空氣相對(duì)濕度（70±5）%;光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000 lx，每天光照12 h，無糖蛭石暴露培養(yǎng)生根每孔接一株，接完后蓋好瓶蓋并置于苗圃自然散射光下進(jìn)行培養(yǎng)。每周觀察、拍照記錄。35 d后統(tǒng)計(jì)生根率（%）、生根數(shù)（條/株）、根長（cm）和根粗（mm），并觀察根系和小苗生長狀況以綜合評(píng)價(jià)生根效果。其中，生根率（%）=生根的組培芽數(shù)/接種組培芽總數(shù)×100，根粗（mm）以電動(dòng)游標(biāo)卡尺測(cè)量，根長（cm）以直尺測(cè)量。每處理10瓶或10盒，每瓶（盒）10～12株，3次重復(fù)。

1. 2. 6 分生結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)和植株再生

將雙子葉體細(xì)胞胚狀體從叢狀胚狀體中單獨(dú)剔剝下來，接種到體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚狀體的胚芽萌發(fā)和胚根伸長，以形成具有完整主根和莖葉的體細(xì)胞胚狀體再生植株。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，分化出的雙子葉分生結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚在原體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L或不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的空白培養(yǎng)基上，只有少部分能分化出胚根和胚芽，而在6-BA 1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+赤霉素（GA3）0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，大多數(shù)體胚能正常萌發(fā)，但植株相對(duì)瘦弱或褐死。為提高分生結(jié)節(jié)體胚植株再生頻率，體胚誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基以改良MS為基本培養(yǎng)基，在添加植物生長調(diào)節(jié)劑IAA 2.0 mg/L和GA3 0.5 mg/L的基礎(chǔ)上，添加6-BA 0.2～1.0 mg/L、CH 200.0 mg/L、蔗糖30.0 g/L、活性炭0.1%及植物凝膠2.4 g/L，pH 5.5。培養(yǎng)條件同1.2.4。培養(yǎng)30～40 d后，觀察記錄體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)和植株再生情況，以體細(xì)胞胚萌發(fā)率（%）及體胚再生植株生長情況作為萌發(fā)效果指標(biāo)。其中，體細(xì)胞胚萌發(fā)率（%）=胚芽萌發(fā)大于1 cm和胚根伸長長于1.5 cm的體細(xì)胞胚狀體數(shù)/接種體細(xì)胞胚狀體總數(shù)×100，植株再生率（%）=形態(tài)完整的體胚苗/接種成熟體細(xì)胞胚狀體數(shù)×100。

1. 2. 7 分生結(jié)節(jié)組織再生植株移栽 將瓶苗置于自然散射光下煉苗1周后，用鑷子取出，洗凈小苗基部培養(yǎng)基，在50%多菌靈可濕性粉劑800倍液中浸泡片刻，然后將小苗移栽到放置于苗圃內(nèi)可降解營養(yǎng)缽（寬12.5 cm×高12.5 cm）中?；|(zhì)體積混合比例為磚紅壤土（8）∶蚯蚓土（1）∶椰糠（1）。另外，胚植株小苗移栽時(shí)進(jìn)行斷根處理;無糖蛭石暴露培養(yǎng)生根組培苗移栽時(shí)，將小苗從培養(yǎng)盒穴孔中輕挖出，無需清洗根部蛭石，直接移栽到無坊布育苗袋（寬12.0 cm×高13.0 cm），袋中混合的基質(zhì)為蛭石（8）∶蚯蚓土（1）∶椰糠（1），移栽好的小苗置于溫室中培養(yǎng)，1周后揭去薄膜，噴水以保持移栽環(huán)境相對(duì)濕度在80%以上，移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率、新葉數(shù)及觀察生長情況，綜合評(píng)價(jià)移栽生長情況。移栽成活率（%）=長新根出新葉的苗數(shù)/移栽總數(shù)×100。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同胚齡合子胚對(duì)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

未成熟合子胚分化誘導(dǎo)的成效與胚齡有密切關(guān)系。如表3所示，從幼果至大黃褐果的發(fā)育期間，隨著胚齡的增長，合子胚誘導(dǎo)率逐漸上升，幼果期和小青果期的合子胚誘導(dǎo)率顯著低于中青果期和大黃褐果期的合子胚誘導(dǎo)率（P<0.05，下同），且后兩者間無顯著差異（P>0.05，下同）。各階段的誘導(dǎo)類型也各不相同。以幼果期的幼嫩種子為外植體時(shí)，僅誘導(dǎo)出少量疏松的愈傷組織（圖2-A），后期未見再分化;小青果未成熟胚以誘導(dǎo)質(zhì)地致密的分生結(jié)節(jié)組織為主（圖2-B），生長較慢;中青果未成熟胚以誘導(dǎo)質(zhì)地脆嫩的分生結(jié)節(jié)組織為主（圖2-C），生長較快;大黃褐果未成熟胚則以萌發(fā)成胚苗為主（圖2-D），分化少量的致密分生結(jié)節(jié)組織和不定芽。因此，選用小青果和中青果未成熟胚作為外植體較優(yōu)，尤其以中青果未成熟胚為外植體可誘導(dǎo)出大粒、均勻、生長旺盛、飽滿且利于后期再分化的分生結(jié)節(jié)組織，最適宜作為海南地區(qū)油茶未成熟胚分生結(jié)節(jié)組織誘導(dǎo)的外植體。

2. 2 不同濃度和配比植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)分生結(jié)節(jié)組織增殖的影響

在不同類型植物分生結(jié)節(jié)發(fā)生增殖過程中起主導(dǎo)作用的植物生長調(diào)節(jié)劑也各不相同。將中青果未成熟胚（圖3-A）誘導(dǎo)出的分生結(jié)節(jié)組織接種在添加不同濃度KT、6-BA和NAA的增殖培養(yǎng)基上，置于自然散射光下培養(yǎng)。每隔20～25 d繼代1次，經(jīng)2次繼代后，其增殖系數(shù)為3.1～5.0（表4）。當(dāng)NAA為0.2 mg/L時(shí)，分別添加不同濃度的KT或6-BA對(duì)增殖系數(shù)影響不顯著，低濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)大粒、質(zhì)地致密的結(jié)節(jié)組織，但隨著濃度的增加，誘導(dǎo)出的結(jié)節(jié)組織質(zhì)地脆嫩，且結(jié)節(jié)組織粒趨小。以KT與NAA組合時(shí)，分生結(jié)節(jié)生長旺盛有活力，增殖同步性好，未見分化;以6-BA與NAA組合時(shí)分生結(jié)節(jié)較早出現(xiàn)褐變壞死，組織趨于分化。未添加NAA時(shí)，復(fù)合添加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT，其增殖系數(shù)與添加KT和NAA或6-BA和NAA的差異不顯著，但結(jié)節(jié)粒生長扁平不一且有褐變壞死;復(fù)合添加2.0 mg/L以上的KT和6-BA時(shí)，增殖系數(shù)呈下降趨勢(shì)，且結(jié)節(jié)組織出現(xiàn)玻璃化致畸及褐變壞死。可見，改良MS+KT 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L是適宜的分生結(jié)節(jié)組織增殖培養(yǎng)基，其培養(yǎng)獲得的分生結(jié)節(jié)組織粒生長大小均勻、形狀規(guī)則且有活力（圖3-B），未見有提前分化。

2. 3 不同濃度和配比植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)分生結(jié)節(jié)再分化的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度和配比對(duì)組織再分化誘導(dǎo)至關(guān)重要，不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不同植物種類的影響存在明顯差異。中青果未成熟胚誘導(dǎo)的分生結(jié)節(jié)組織在增殖一定量后，選取生長飽滿健壯、同步性好的分生結(jié)節(jié)塊分別接種至6種分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再分化。如表5所示，分生結(jié)節(jié)組織在6種培養(yǎng)基上培養(yǎng)40～60 d后，均能不同程度地啟動(dòng)再分化，培養(yǎng)材料同時(shí)存在正常增殖的分生結(jié)節(jié)組織、致密將分化的分生結(jié)節(jié)組織、已分化的不定芽、已分化的成熟體細(xì)胞胚狀體，甚至存在再脫分化形成的愈傷組織等（圖4）。分生結(jié)節(jié)組織在①～④號(hào)培養(yǎng)基上的分化效果明顯優(yōu)于⑤號(hào)和⑥號(hào)培養(yǎng)基，其中，②號(hào)培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化率影響不明顯，但體細(xì)胞胚狀體分化率、每塊結(jié)節(jié)不定芽分化數(shù)和每塊結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚狀體分化數(shù)分別較①號(hào)培養(yǎng)基顯著增加24.6%、86.0%和233.3%;③號(hào)培養(yǎng)基的不定芽分化率、分化數(shù)與②號(hào)培養(yǎng)基差異不顯著，但與①號(hào)培養(yǎng)基相比體細(xì)胞胚狀體分化率顯著提高92.5%、每塊結(jié)節(jié)的體細(xì)胞胚狀體分化數(shù)顯著增加將近10.0倍;④號(hào)培養(yǎng)基較①號(hào)培養(yǎng)基其不定芽分化率顯著提高29.9%，每塊結(jié)節(jié)不定芽分化數(shù)顯著增加162.8%，而體細(xì)胞胚狀體分化數(shù)較③號(hào)培養(yǎng)基略有上升，但每塊結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚狀體分化率顯著下降。綜上所述，在6種分化培養(yǎng)基中，分生結(jié)節(jié)分化主要以不定芽為主，其中在④號(hào)培養(yǎng)基中不定芽分化率達(dá)56.0%，每塊結(jié)節(jié)分化不定芽11.3個(gè)，最適合結(jié)節(jié)分化不定芽;③號(hào)培養(yǎng)基則更適合體細(xì)胞胚狀體的分化，體細(xì)胞胚狀體分化率達(dá)48.5%，每塊結(jié)節(jié)分化體細(xì)胞胚狀體6.5個(gè)，但按分化總組培芽苗數(shù)（不定芽+體細(xì)胞胚狀體）計(jì)算，④號(hào)培養(yǎng)基分化的組培芽苗總數(shù)顯著高于③號(hào)培養(yǎng)基。因此，可根據(jù)生產(chǎn)需要選擇相應(yīng)的分生結(jié)節(jié)分化途徑，進(jìn)一步優(yōu)化利用。

2. 4 分生結(jié)節(jié)再分化芽的生根及植株再生情況

將分生結(jié)節(jié)再分化芽接種到8種培養(yǎng)基或培養(yǎng)基質(zhì)上，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。如表6和圖5所示，以常規(guī)組培瓶?jī)?nèi)生根的方式，單獨(dú)添加0.5 mg/L IBA（①處理）和5.0 mg/L IBA（②處理）均無法誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)再生芽生根，苗基部無明顯變化或呈基部膨大，但添加IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L（③處理）或IBA 5.0 mg/L+NAA 5.0 mg/L（④處理）能誘導(dǎo)生根，生根率分別為4.3%和3.6%，除了④處理的根粗較③處理顯著增大外，二者的根數(shù)和根長均無顯著差異;組培苗基部浸泡200.0 mg/L NAA的⑤處理無明顯促進(jìn)生根，但浸泡200.0 mg/L IBA的⑥處理顯著促進(jìn)組培芽生根，生根率提高了31.7倍，達(dá)65.3%，生根數(shù)最多，每株組培苗約有6.7條白色不定根，是其他處理的1.8～5.2倍，不定根被有根毛，側(cè)根少，根質(zhì)地呈輕松泡狀。以無糖蛭石暴露培養(yǎng)生根時(shí)，促進(jìn)生根的效果較以200.0 mg/L IBA浸泡組培苗后常規(guī)瓶?jī)?nèi)生根的效果更明顯，添加IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L（⑦處理）和IBA 5.0 mg/L+NAA 5.0 mg/L（⑧處理）的生根率分別較200.0 mg/L IBA浸泡處理（⑥處理）的瓶?jī)?nèi)生根顯著提高19.1%和21.0%，三者間的根長差異不顯著，但2種無糖[]石暴露培養(yǎng)生根苗的根粗較以200.0 mg/L IBA浸泡（⑥處理）的瓶?jī)?nèi)生根均顯著增加25.0%，且無糖蛭石暴露培養(yǎng)生根苗的白綠色不定根側(cè)根增多、被根毛且根的質(zhì)地堅(jiān)實(shí)柔韌，增大整個(gè)根的表面積，促使根部吸水效率更高，故無糖蛭石暴露培養(yǎng)生根苗是分生結(jié)節(jié)再生芽生根的最適方式，無糖培養(yǎng)基添加IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的生根效率最高。

2. 5 分生結(jié)節(jié)再分化體細(xì)胞胚狀體的萌發(fā)及植株再生情況

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，分生結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚在原體胚分化培養(yǎng)基或未添加植物生長調(diào)節(jié)劑的常規(guī)體胚分化培養(yǎng)基上無法萌發(fā)成苗，在改良MS+IAA 2.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的條件下雖然能分化出胚芽和胚根，但體細(xì)胞胚狀體再生小苗細(xì)瘦、真葉展開慢、主根短。為此，本研究適當(dāng)降低6-BA用量，結(jié)果顯示在IAA 2.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L的條件下，隨著6-BA濃度的減少，植株再生率呈遞增趨勢(shì)（表7），相對(duì)于1.0 mg/L的用量，僅添加0.2和0.5 mg/L 6-BA時(shí)的體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)率分別顯著提高8.6%和11.9%，植株再生率分別顯著提高36.7%和22.1%;且0.2 mg/L 6-BA處理的根芽更健壯，后期真葉抽生較快（圖6）。因此，分生結(jié)節(jié)體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)小苗時(shí)以改良MS+IAA 2.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L更適合。

2. 6 未成熟胚分生結(jié)節(jié)組織再生植株的移栽效果

如表8所示，與常規(guī)組培生根芽生小苗的移栽成活率相比，常規(guī)組培體細(xì)胞胚狀體再生根小苗的移栽成活率顯著提高27.6%，無糖暴露生根芽生小苗的移栽成活率顯著提高23.5%，且二者間無顯著差異。依據(jù)移栽小苗新葉和新根長出的時(shí)間，緩苗期最短的是無糖暴露生根芽生小苗，僅需1周左右，其次是常規(guī)組培體細(xì)胞胚狀體再生小苗，緩苗時(shí)間最長的是常規(guī)組培生根芽生小苗，較無糖暴露生根芽生小苗約推遲9 d。移栽30 d后觀測(cè)移栽小苗的長勢(shì)（圖7）發(fā)現(xiàn)，以常規(guī)組培體細(xì)胞胚狀體再生小苗緩苗適應(yīng)最好，長新葉快，2～3片，葉片平展、深綠色，緩苗期間未見明顯的黃葉或落葉;其次是無糖暴露生根芽生小苗，新葉生長正常，1～2片，葉片平展寬大、深綠色，緩苗期間少有黃葉或落葉;而常規(guī)組培生根芽生小苗的新葉生長慢，葉片綠色，部分小苗葉片不夠平整，部分植株有黃葉或落葉。

3 討論

3. 1 適合海南地區(qū)油茶合子胚誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)組織的最佳發(fā)育期

選擇合適外植體是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵（王睿輝等，2002）。本研究發(fā)現(xiàn)，盛花期后240～300 d的中青果未成熟合子胚在改良MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其分生結(jié)節(jié)組織誘導(dǎo)率接近90.0%，分生結(jié)節(jié)細(xì)胞生長旺盛，未見褐死現(xiàn)象;在改良MS+KT 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上增殖的分生結(jié)節(jié)組織粒大小均勻、形狀規(guī)則、有活力且同步性狀未見有提前分化，后續(xù)在合適的分化培養(yǎng)基上總分化誘導(dǎo)率約90.0%。說明中青果未成熟合子胚是適宜海南地區(qū)油茶誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)的適宜外植體，與胡玉玲等（2014）報(bào)道普通油茶長林53號(hào)以果實(shí)迅速膨大期的子葉為最佳體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)外植體的結(jié)論一致，即此時(shí)期油茶幼胚中相對(duì)高含量的可溶性蛋白、相對(duì)低含量的可溶性糖及高比例的ABA/ZR均可促進(jìn)外植體的器官分化。未成熟胚發(fā)育處于胚發(fā)育旺盛時(shí)期，幼嫩的生殖器官胚性細(xì)胞活力強(qiáng)，更有利于直接分化胚性明顯的分生結(jié)節(jié)組織、體細(xì)胞胚狀體等（叢建民等，2012）。蔡玲等（2012）以岑軟3號(hào)油茶成熟胚子葉為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率為30.0%，分化率僅為11.1%，分化結(jié)果均為不定芽，未見有體細(xì)胞胚狀體發(fā)生。本研究以盛花期后300～370 d的大黃褐果合子胚為外植體，其誘導(dǎo)結(jié)果以胚芽萌發(fā)成苗為主，而鮮見胚性愈傷組織、分生結(jié)節(jié)或體細(xì)胞胚狀體等其他器官和組織。

3. 2 油茶未成熟胚再生植株的初代誘導(dǎo)、增殖與分化

植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生再生植株的途徑通常分為器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚狀體發(fā)生途徑，除此之外，近年來研究較多的是分生結(jié)節(jié)植株再生途徑，且證實(shí)在啤酒花（Humulus lupulus Linn.）、朝鮮白頭翁（Pulsatilla koreana）及牡丹（Paeonia sect. Moutan）等植物中均存在分生結(jié)節(jié)組織同時(shí)分化多種組織和器官的現(xiàn)象（鐘原等，2011;廉玉姬，2013）。長林53號(hào)油茶未成熟胚子葉在MS+2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+TDZ 0.05 mg/L+Gly 500 mg/L上培養(yǎng)120 d，體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)率為83.0%，體細(xì)胞胚狀體在MS+IAA 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+CH 500.0 mg/L上誘導(dǎo)萌發(fā)40 d，體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)率為73.0%，歷時(shí)約165 d，按幼胚子葉誘導(dǎo)胚性愈傷組織→胚性愈傷組織增殖→胚性愈傷組織體細(xì)胞胚狀體發(fā)生→體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)的過程完成分化，以體細(xì)胞胚狀體發(fā)生途徑進(jìn)行植株再生（胡玉玲等，2014）。湘林4號(hào)油茶的幼胚和子葉在MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L上培養(yǎng)25 d后愈傷組織誘導(dǎo)率分別為78.0%和73.0%，部分愈傷組織繼代2次約50 d可誘導(dǎo)出不定芽，幼胚和子葉的愈傷組織在MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率分別為95.0%和100.0%，再繼代3次可獲得叢生芽，有類似胚狀體的細(xì)胞團(tuán)但最終未能分化為完整植株，歷時(shí)約165 d ，按芽幼胚組織誘導(dǎo)愈傷組織→愈傷組織分化不定芽→不定芽增殖的過程完成分化，以器官發(fā)生途徑進(jìn)行植株再生（畢方鋮等，2004）。本研究中，中青果未成熟合子胚在改良MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+CW 5%培養(yǎng)基上誘導(dǎo)45 d，誘導(dǎo)率約90.0%，以直接分化分生結(jié)節(jié)組織為主，有少量幼胚萌發(fā)成苗，分生結(jié)節(jié)在改良MS+KT 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+CW 10%上培養(yǎng)25 d，其增殖系數(shù)為4.6～4.7，增殖后的分生結(jié)節(jié)經(jīng)分化培養(yǎng)60 d，在改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+CW 10%+CH 400.0 mg/L+AC 0.1%上的體細(xì)胞胚狀體分化率為48.5%，每塊分生結(jié)節(jié)分化6.5個(gè)體細(xì)胞胚狀體，不定芽分化率為41.5%，每塊分生結(jié)節(jié)分化9.0個(gè)不定芽，在改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+CW 10%+CH 400.0 mg/L+AC 0.1%上的不定芽分化率為56.0%，每塊分生結(jié)節(jié)分化11.3個(gè)不定芽，體細(xì)胞胚狀體分化率為32.3%，每塊分生結(jié)節(jié)分化6.7個(gè)體細(xì)胞胚狀體，體細(xì)胞胚狀體在改良MS+IAA 2.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+CH 200.0 mg/L+AC 0.1%上進(jìn)行30～40 d誘導(dǎo)萌發(fā)，萌發(fā)率為72.1%，按幼胚誘導(dǎo)直接分化分生結(jié)節(jié)→分生結(jié)節(jié)增殖→分生結(jié)節(jié)再分化體細(xì)胞胚狀體和不定芽的過程完成啟動(dòng)誘導(dǎo)、增殖和器官分化（歷時(shí)160～170 d），以分生結(jié)節(jié)發(fā)生途徑進(jìn)行植株再生。

可見，不同品種油茶的幼胚組織外植體在不同適宜條件下歷時(shí)160～170 d完成幼胚組織的啟動(dòng)誘導(dǎo)、增殖和分化，經(jīng)體胚發(fā)生、器官（不定芽）發(fā)生或分生結(jié)節(jié)發(fā)生途徑進(jìn)行分化，在相同時(shí)間內(nèi)，根據(jù)外植體啟動(dòng)（愈傷組織或分生結(jié)節(jié)）誘導(dǎo)率、（愈傷組織、芽或分生結(jié)節(jié)）增殖系數(shù)、器官（不定芽或體細(xì)胞胚狀體）分化率及體細(xì)胞胚狀體萌發(fā)率等指標(biāo)計(jì)算分化器官的總數(shù)，分生結(jié)節(jié)途徑植株再生方式通過分生結(jié)節(jié)的迅速、穩(wěn)定增殖，在較短時(shí)間內(nèi)能有效擴(kuò)大器官分化材料基數(shù)，再分化出體細(xì)胞胚狀體和不定芽，相對(duì)于體細(xì)胞胚狀體發(fā)生途徑和不定芽發(fā)生途徑，該途徑對(duì)提高后續(xù)植株再生頻率的潛力更大。海南本土油茶在改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ZT 5.0 mg/L+CW 10%+CH 400.0 mg/L+AC 0.1%的培養(yǎng)基上以分化體細(xì)胞胚狀體為主，該結(jié)論也為其他外植體通過分生結(jié)節(jié)植株再生途徑提供了借鑒經(jīng)驗(yàn)。

3. 3 分生結(jié)節(jié)再生植株的生根和移栽

以湘林4號(hào)油茶幼胚和幼胚子葉為外植體，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)獲得的不定芽用MS培養(yǎng)基添加NAA和IBA進(jìn)行培養(yǎng)，其生根效果均較好，以NAA 7.0 mg/L的生根最佳，生根率達(dá)93.3%，根系粗壯，不定根上無側(cè)根生長，被有白色根毛，不定根細(xì)弱，易折斷，可能與油茶的遺傳特性有關(guān);當(dāng)NAA和IBA添加濃度大于7.0 mg/L時(shí)則抑制生根，并出現(xiàn)葉片發(fā)黃枯死現(xiàn)象（畢方鋮等，2004）;以湘林4號(hào)油茶萌發(fā)膨大的子葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織則先分化出體細(xì)胞胚，再經(jīng)體細(xì)胞胚狀體分化不定芽，將不定芽叢生芽以2～3個(gè)小芽同愈傷組織一起切下進(jìn)行生根培養(yǎng)，其生根結(jié)果良好。本研究的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以MS+IBA 5.0 mg/L或MS+NAA 5.0 mg/L均未能誘導(dǎo)生根，但改良MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L或IBA 5.0 mg/L+NAA 5.0 mg/L能少部分誘導(dǎo)生根，且二者差異不明顯;以200.0 mg/L NAA或IBA浸芽基部后在改良MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NAA浸芽處理依然未能明顯促進(jìn)不定芽生根，而IBA浸芽處理顯著提高不定芽生根率至65.3%，平均每株生根6.7條，平均根長3.2 cm，平均根粗1.6 mm，移栽成活率74.2%。袁德義等（2013）研究表明，華鑫油茶葉片誘導(dǎo)的不定芽，經(jīng)1000 mg/L IBA浸芽基部處理5 s轉(zhuǎn)入1/2MS空白培養(yǎng)基培養(yǎng)50 d后，其生根率高達(dá)88.3%，平均根長3.72 cm，每株平均根數(shù)8條，移栽成活率可達(dá)82.5%。可見，利用合適植物生長調(diào)節(jié)劑浸芽處理能顯著提高不定芽的生根效果，但存在操作繁瑣、易污染及根形態(tài)欠佳等缺陷。

為進(jìn)一步提高不定芽生根效果，本研究將分生結(jié)節(jié)不定芽接種在1/2改良MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L無糖蛭石暴露培養(yǎng)，其生根率顯著增加至77.8%，根的形態(tài)也得到明顯改善，白綠色不定根的根粗明顯增加，側(cè)根增多，可有效增加根吸收面積，根的質(zhì)地堅(jiān)實(shí)柔韌不易斷，且縮短成苗時(shí)間和提高煉苗效率，移栽成活率達(dá)91.6%，較IBA浸芽處理的瓶?jī)?nèi)生根操作更方便，是適合分生結(jié)節(jié)小苗的最佳生根方法。今后，可通過添加ABT（王以紅等，2011;吳幼媚等，2012）等輔助生根劑、優(yōu)化篩選IBA+NAA復(fù)合添加濃度等進(jìn)一步改良優(yōu)化以提高生根效率。袁德義等（2013）研究表明，在相同的植物生長調(diào)節(jié)劑條件下，瓶?jī)?nèi)生根苗移栽效率高于用扦插專用基質(zhì)進(jìn)行瓶外生根。但本研究結(jié)果表明，在IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L條件下，無糖暴露培養(yǎng)生根效果明顯優(yōu)于瓶?jī)?nèi)生根，主要是瓶?jī)?nèi)生根的不定根多由植株莖上表皮誘導(dǎo)而來，此時(shí)培養(yǎng)基碳源是植株根系碳同化物的主要來源，根系與莖的聯(lián)系較弱，水分及養(yǎng)分供給不足，故移栽成活率相對(duì)較低;而利用組培芽扦插進(jìn)行無糖暴露試管外假植生根，主要通過內(nèi)源激素的作用誘導(dǎo)出形態(tài)優(yōu)良的不定根，由組培芽光合作用提供碳源，并通過莖運(yùn)輸?shù)礁?，增?qiáng)根系與莖的聯(lián)系，不斷增強(qiáng)根的適應(yīng)性，根系活力相對(duì)高，移栽成活率明顯提高（郭成等，2017）。體細(xì)胞胚狀體再生組培苗通過主根斷根處理，移栽成活高，且新葉長出時(shí)間早、新根發(fā)根數(shù)量多，再次佐證體細(xì)胞胚狀體發(fā)生再生植株的優(yōu)越性（Ardiyani，2015;Klubicová et al.，2017），今后可進(jìn)一步改良芽分化培養(yǎng)基，有效提高分生結(jié)節(jié)途徑植株再生效率。

4 結(jié)論

以油茶未成熟合子胚為外植體，通過分生結(jié)節(jié)組織方式增殖，可經(jīng)體細(xì)胞胚狀體發(fā)生和不定芽發(fā)生兩種途徑成功建立海南油茶未成熟胚分生結(jié)節(jié)植株再生體系。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）