炎癥微環(huán)境下大鼠下頜骨缺損模型的建立

羅夢琳 李巖 賈駿麒 余凡 陳吉華

牙周炎與心血管、糖尿病并成為是世界范圍內(nèi)的三大類慢性疾病[1-2]?？谇活M骨因其解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并且口腔處于開放污染環(huán)境中，一旦發(fā)生區(qū)域性的炎癥，炎癥范圍難以控制[3]。

目前已經(jīng)成熟建立顱骨骨缺損與長骨骨缺損的模型，但以上位置的骨缺損的微環(huán)境并不能完全模擬頜骨骨缺損的缺損周圍微環(huán)境[4]。此外，顱骨和長骨缺損區(qū)域不包含牙齒，這限制了其作為應(yīng)用模型的多功能性。因此，亟需一種新的動物模型評價口腔頜骨缺損修復(fù)的效果。理想的骨缺損修復(fù)模型稱為極限缺損模型(CSD)[5]，指在生物存活時間內(nèi)無法愈合的最小尺寸的缺損。而目前，并沒有成熟的口腔頜骨骨缺損的動物模型。

本研究的目的是嘗試以SD大鼠為模型，建立一種炎癥環(huán)境下的，易于制造，可重復(fù)性高，缺損不能自行愈合，且不影響咀嚼功能的下頜骨缺損模型。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康成年雄性SD大鼠33 只(約300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，其中18 只隨機(jī)分為3 組，每組6 只，分別為建立不同大小缺損的3、 4、 5 mm組；所有大鼠均在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院動物中心的SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 牙周炎模型的建立

所有大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉(w/V)按照0.167 ml/100 g劑量對其進(jìn)行腹腔麻醉，拍攝造模前micro-CT(Siemens,德國)，測量下頜第一磨牙遠(yuǎn)中根分叉頂點到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。固定大鼠后，使用正畸結(jié)扎絲從大鼠下頜第一、二磨牙間隙穿入，于下頜第一磨牙近中結(jié)扎并收緊，使結(jié)扎絲嵌入齦溝中。每兩天于下頜第一磨牙頰側(cè)牙齦緣下方約3 mm處注射2.5 μg LPS-PG(Invivogen，美國)。1 個月后，拆除結(jié)扎絲，micro-CT檢查造模結(jié)果，并測量下頜第一磨牙近、遠(yuǎn)中根釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。

1.3 不同直徑缺損模型的探究

大鼠腹腔麻醉，備皮后常規(guī)消毒鋪巾，沿下頜下緣切開約2 cm，分離軟組織及肌肉，暴露下頜骨，切斷咬肌粗隆，在不影響動物咀嚼效率的情況下，于磨牙位置的牙槽嵴頂下1～2 mm處，采用制備圓形全層骨缺損的方法,分別制造直徑3、 4、 5 mm的垂直于骨面的貫通缺損，收集骨塊進(jìn)行組織學(xué)觀察。嚴(yán)密縫合肌肉及皮膚(圖 1)。于術(shù)后每周缺損局部注射1.0 μg LPS-PG。 于術(shù)后0、 4、 8、 12 周進(jìn)行micro-CT檢查。

1.4 組織學(xué)觀察

圖 1 制造大鼠下頜骨缺損模型手術(shù)過程

標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h；浸泡在10%的EDTA脫鈣液中于37 ℃恒溫?fù)u床上脫鈣2 周后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后，體視顯微鏡(Olympus,日本)下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用 SPSS 19.0(SPSS，USA)軟件，各組之間差異比較采用單因素方差分析檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周炎模型的建立

牙周炎模型建立結(jié)果由造模前后micro-CT重建圖像和下頜第一磨牙近、遠(yuǎn)中根釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂距離變化來衡量。結(jié)果顯示：三維重建圖像可以直觀看出所有組大鼠的下頜第一磨牙處的牙槽骨高度明顯降低(圖 2A～C)；測量結(jié)果可以看出，各組大鼠下頜第一磨牙近中的釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂距離由(0.87±0.04) mm降低為(1.51±0.14) mm，降低了約(0.64±0.15) mm，遠(yuǎn)中的釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂距離由(0.91±0.04) mm降低為(1.21±0.04) mm，降低了約(0.30±0.05)mm，造模前后有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(圖 2D～E)。這結(jié)果提示下頜炎癥環(huán)境構(gòu)建成功。

2.2 組織學(xué)觀察

在已經(jīng)建立完成的牙周炎模型基礎(chǔ)上建立缺損模型，術(shù)中骨塊HE染色可以看到大量中性粒細(xì)胞浸潤，牙根周圍骨組織破壞，并有中性粒細(xì)胞和血管充填其中，部分中心粒細(xì)胞涉及牙周膜(圖 3B)。頰側(cè)骨質(zhì)有大量破壞，可以看到骨皮質(zhì)不完整，臨近組織水腫，可見新生血管(圖 3D)，組織學(xué)觀察證明牙周膜、牙槽骨和牙周軟組織有明顯的炎癥，炎癥造模成功。

圖 2 牙周炎模型micro-CT 3D重建

術(shù)后12 周取3 mm缺損的標(biāo)本，HE染色可見缺損并未完全修復(fù)(圖 4)，缺損周圍有大量炎細(xì)胞浸潤，并有血管生成，證明在術(shù)后12 周時，下頜骨缺損處仍處于炎癥微環(huán)境中。

圖 4 3 mm缺損形成后12 周(HE, A: ×20; B：×150)

Fig 4 3 mm defect 12 weeks after operation(HE, A: ×20; B：×150)

2.3 不同直徑下頜骨缺損模型的探究

術(shù)后即刻及4、 8、 12 周活體micro-CT跟蹤掃描顯示：3、 4、 5 mm 直徑的下頜骨缺損均有持續(xù)的、少量的恢復(fù),均未能完全形成缺損底部橋接,缺損未能完全修復(fù)(圖 5)。計算各組骨量恢復(fù)百分比，結(jié)果顯示：3 mm組在第12 周時骨量恢復(fù)了約42.1%±1.02%，4 mm組骨量恢復(fù)了21.2%±1.37%，5 mm組骨量恢復(fù)了12.8%±0.83%。 3 組不同直徑的缺損雖在觀察時間內(nèi)都未完全修復(fù)，但4、 5 mm組缺損面積過大，余留骨邊緣過窄，術(shù)后下頜骨骨折比例稍高(4 mm組1 例骨折，5 mm組3 例骨折)，且缺損涉及下切牙，大鼠進(jìn)食受到影響，死亡率及并發(fā)癥發(fā)生率較高(4 mm組死亡1 例，5 mm組死亡1 例)。相比較而言，3 mm組大鼠無一例骨折，并發(fā)癥發(fā)生率與另兩組相比大大降低，即造模后大鼠飼養(yǎng)難度較低，這樣便充分保證了樣本數(shù)量從而保證了實驗的統(tǒng)計學(xué)意義，所以選擇3 mm直徑的缺損作為炎癥環(huán)境下的大鼠下頜骨的極限骨缺損。

3 討 論

本實驗采用LPS-PG局部注射和正畸絲結(jié)扎的方式成功建立大鼠牙周炎模型，通過每周持續(xù)局部注射1.0 μg劑量的LPS-PG來維持下頜炎癥環(huán)境，并在該模型的牙周炎癥累及區(qū)域分別建造了3、 4、 5 mm的圓形貫穿骨缺損，最終確定3mm直徑的缺損可以成為炎癥狀態(tài)下SD大鼠下頜骨骨缺損模型的CSD尺寸，該尺寸為SD大鼠存活時間內(nèi)在該周圍炎癥微環(huán)境下下頜骨無法愈合的最小尺寸的缺損，并且該缺損造成SD大鼠并發(fā)癥與死亡的發(fā)生率較低，這樣便可以保證充分的樣本量以使實驗獲得充分的統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究使用micro-CT對大鼠下頜骨缺損愈合情況跟蹤掃描并結(jié)合組織學(xué)研究，通過缺損范圍和術(shù)后缺損修復(fù)及炎癥反應(yīng)三方面來評估三種不同直徑的缺損。與4 mm和5 mm缺陷相比，3 mm缺損在術(shù)后4 周時有明顯的骨愈合。到8 周時，不同缺損大小組間骨愈合的差異進(jìn)一步增大，所有3 mm缺損均表現(xiàn)出完全的骨愈合和輪廓再生，而4、 5 mm缺損愈合情況有限，即使延長了觀察時間，也僅有少量骨充填。通過micro-CT生成的3D模型而產(chǎn)生的定性數(shù)據(jù)對于評估整個缺陷體積中骨愈合的細(xì)節(jié)尤其有用。在缺損的樣本中骨連接不完整，缺損的中心沒有骨再生。組織學(xué)分析也進(jìn)一步證實了該結(jié)果。本研究推測大直徑的缺損可能阻止了成骨生長因子和成骨前體細(xì)胞到達(dá)缺損的中心，這極大地阻礙了缺損中的橋接形成。此外，組織學(xué)研究顯示，與3 mm缺損相比，4、 5 mm缺損容易出現(xiàn)骨折、感染等并發(fā)癥。因此，在炎癥環(huán)境下，去除了頰側(cè)和舌側(cè)骨皮質(zhì)，包括牙槽骨和牙根的3 mm缺損，在12 周后未顯示下頜骨缺損完全修復(fù)的現(xiàn)象，可被定義為SD大鼠下頜骨的CSD模型。

圖 5 不同直徑缺損愈合圖

本研究建立的下頜骨骨缺損的模型可用于評估炎癥環(huán)境下生物材料促進(jìn)骨再生的能力和藥物緩釋策略解決炎癥環(huán)境下下頜骨缺損的能力。此外，該模型可用于測試炎癥環(huán)境下承擔(dān)咀嚼應(yīng)力的種植體的骨結(jié)合強(qiáng)度或應(yīng)用于顱面組織工程和牙科中的其他領(lǐng)域，例如炎癥環(huán)境下牙齒再生或牙槽骨與牙齒同步再生。該模型的建立，為評價頜骨缺損修復(fù)效果，包括多種組織類型的功能性的重建(例如：骨，軟組織，牙齒，神經(jīng))，提供了安全和有效的驗證平臺。