miR-451a和MMP-2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及對腫瘤細胞增殖的影響

倪浩亮 韓越俊 金晰函 杜金林

[摘要] 目的 探討miR-451a和MMP-2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達情況及兩者對腫瘤細胞增殖的影響。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡分別檢測結(jié)直腸癌組織與癌旁組織（來自2018年金華市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標本），多個腫瘤細胞系中miR-451a的表達和MMP-2蛋白的表達;在HCT116細胞系中過表達miR-451a（miR-451a-mimic）檢測MMP-2蛋白表達;miR-451a-mimic或沉默MMP-2表達檢測細胞增殖情況。結(jié)果 在結(jié)直腸癌組織中miR-451a表達明顯下降，MMP-2蛋白的表達顯著升高，這種結(jié)果同時出現(xiàn)在各個結(jié)直腸癌細胞株中，以HCT116細胞株最為明顯;在HCT116細胞系中miR-451a-mimic顯著減少MMP-2蛋白表達量，miR-451a-mimic或沉默MMP-2均會抑制腫瘤細胞的增殖。 結(jié)論 miR-451a在結(jié)直腸癌組織中表達明顯降低，其本身可能通過抑制MMP-2蛋白的表達來抑制腫瘤細胞的增殖。

[關(guān)鍵詞] miR-451a;MMP-2;結(jié)直腸癌;增殖

[中圖分類號] R735.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）09-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in colorectal cancer tissues and their effects on tumor cell proliferation. Methods Reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting were used to detect the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in multiple tumor cell lines in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues （from the specimens surgically resected by Jinhua Central Hospital in 2018）， respectively. The expression of MMP-2 protein was detected by over-expression of miR-451a（miR-451a-mimic） in HCT116 cell lines; cell proliferation was detected by miR-451a-mimic or by silencing MMP-2 expression. Results The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues significantly decreased， while the expression of MMP-2 protein significantly increased; this result was found in all colorectal cancer cell lines simultaneously， with the HCT116 cell line being the most obvious; miR-451a-mimic significantly reduced the expression of MMP-2 protein in HCT116 cell lines， and miR-451a-mimic or silencing MMP-2 inhibited the proliferation of tumor cells. Conclusion The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues is significantly reduced， which itself may inhibit the proliferation of tumor cells by inhibiting the expression of MMP-2 protein.

[Key words] miR-451a; MMP-2; Colorectal cancer; Proliferation

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。全世界約有50%的CRC患者死于遠處轉(zhuǎn)移[2-3]。盡管CRC的診斷和治療有所改善，但每年有超過60萬例患者死于CRC。近年來由于飲食結(jié)構(gòu)和生活水平的改變，該病在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢[4]。miR-451最早是由Altuvia等[5]在2005年從人腦垂體RNA中提取并命名，位于17q11.2染色體上?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metal proteinase 2，MMP-2）參與腫瘤基底膜和細胞外基質(zhì)的降解，與腫瘤關(guān)系密切，其高表達可促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。文獻報道顯示miR-451能夠抑制乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細胞肺癌中的細胞生長、增殖、侵襲和遷移[6-8]，但其在結(jié)直腸癌中表達及對結(jié)直腸癌細胞侵襲機制的研究不夠充分。本研究將采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）分析結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-451的表達差異，免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測結(jié)腸癌組織中MMP-2的蛋白表達情況，并探討兩者與結(jié)腸癌的相關(guān)性，以及共同參與細胞增殖抑制的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

12例結(jié)腸癌組織和癌旁組織取自2018年金華市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標本。所有患者術(shù)前均未接受過放化療，術(shù)后病理診斷證實均為結(jié)腸癌Ⅱ期中分化腺癌。標本：男6例，女6例，本研究獲得金華市中心醫(yī)院倫理委員會批準，組織標本的收集均征得患者本人的知情同意。人結(jié)直腸癌細胞株HT29、HCT116、SW480購自中國科學(xué)院上海細胞資源中心，人結(jié)腸正常黏膜上皮細胞株NCM60本實驗室保存;過表達pcDNA-miR451a（pcDNA-miR-451a-mimic）、pcDNA-NC、psilencer-MMP-2pcDNA-MMP-2及對照質(zhì)粒psilencer-Scr由上海吉凱生物公司構(gòu)建，miR-451a RT PCR引物購自北京擎科有限責(zé)任公司;Lipofectamine TM 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;MMP-2抗體購自CST公司;GAPDH抗體、辣根酶過氧化物標記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Realtime-PCR檢測組織及各細胞系中miR-451a的表達? 采用Trizol法提取癌組織、癌旁組織以及各細胞系的總RNA，首先加一定量Trizol，然后以5：1的比例加入氯仿，充分混勻，靜置5 min，然后3000 rpm 4℃離心10 min，取上清加入異丙醇（根據(jù)Trizol量按2：1加）混勻靜置10 min，3000 rpm 4℃離心5 min，去上清，加入75%乙醇洗滌，7500 r/min 4℃離心5 min，去上清，加入DEPC水溶解沉淀。根據(jù)OD260/OD280比值判斷提取RNA的純度，根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求以5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'引 物合成cDNA。按VazymemiRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明，配制PCR反應(yīng)體系，在定量PCR儀器上進行Realtime-PCR，最后用2-△△CT公式計算miR-451a表達量，并且采用內(nèi)參基因u6作為內(nèi)對照。

1.2.2 Western blot檢測組織和各細胞系中MMP-2蛋白水平表達情況? 取100 mg組織置入EP管中，并加入1 mL RIPA蛋白裂解液（已經(jīng)加入蛋白酶抑制劑）。用電動勻漿器置于冰上勻漿，至肉眼不見塊狀組織為止，冰上充分裂解1 h，收集液體;取適量RIPA蛋白裂解液（加入蛋白酶抑制劑）加入6孔板中，機械破碎細胞，冰上充分裂解30 min提取液體。收集好的液體在3000 rpm 4℃條件下離心15 min，去沉淀，BCA法測濃度后置入-80℃儲存?zhèn)溆?。取稀釋好的樣品進行SDS-PAGE電泳（分離膠12%，濃縮膠5%），轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過夜。一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后，再與HRP標記的二抗于室溫孵育1 h，ECL顯色，照相。

1.2.3細胞系中miR-451a-mimic檢測MMP-2表達情況? 細胞均用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DEME培養(yǎng)基在5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。消化細胞收集到12孔板上，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR 451a、pcDNA-NC轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，免疫印跡法檢測MMP-2的蛋白含量，每組重復(fù)3次。

1.2.4 miR-451a-mimic或沉默MMP-2或同時miR-451a-mimic和MMP-2之后MTT法檢測感染細胞的生存狀況? 消化適量細胞收集到96孔板上，每組設(shè)三個重復(fù)孔，待24 h后分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a、psilencer-MMP-2、pcDNA-NC、psilencer-Scr以及同時轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a和pcDNA-MMP-2，在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后在待測孔每孔加入適量MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。每孔加入DMSO150 μL，避光震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。測定570 nm處檢測各孔吸光值（optical density，OD）。繪制對應(yīng)時間的生長曲線。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，雙變量數(shù)據(jù)采用雙因素變量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中miR-451a和MMP-2的表達水平

RT-PCR的結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中的miR-451a表達水平顯著下降，Western blot顯示MMP-2蛋白表達量顯著升高（圖1、表1），在三個人結(jié)直腸癌細胞株中，miR-451a表達水平均顯著下降，MMP-2蛋白表達量均顯著升高，因此為了更好的研究其中機制，選取三種結(jié)直腸癌細胞系分別為HT29、SW480和HCT116來驗證miR-451a和MMP-2在體外的表達。結(jié)果顯示在三種結(jié)直腸癌細胞系中，miR-451a表達水平均下降，而MMP-2蛋白表達量均升高，尤其在HCT116細胞系中miR-451a表達水平下降最為明顯，而MMP-2蛋白表達量則升高最為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2、表2）。進而我們選取HCT116細胞系來進行體外機制的驗證。

2.3結(jié)直腸癌細胞系中miR-451a-mimic、沉默MMP-2對腫瘤細胞增殖的影響

在轉(zhuǎn)染miR-451a-mimic質(zhì)粒、沉默MMP-2質(zhì)粒后，HCT116細胞在48 h后出現(xiàn)對細胞增殖的明顯抑制作用，達到72 h時，抑制效果最為明顯。HCT116細胞系中miR-451a-mimic其48 h和72 h抑制率分別為18.25%和37.23%，沉默MMP2基因后，48 h和72 h抑制率分別為29.54%和43.42%（圖4、表3）。

3討論

miRNA以干擾mRNA翻譯的方式負向調(diào)控基因的表達，能夠與靶基因的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域特異性結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。其中miR-451a被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。Bandres E等[9]研究顯示在胃癌和結(jié)直腸癌細胞株中，miR-451a-mimic可以有效降低巨噬細胞遷移抑制因子的mRNA和蛋白量，從而抑制腫瘤細胞的增殖、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移和促進細胞的凋亡，從而達到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。除此之外，有文獻指出[10]AMP活化蛋白激酶也是miR-451a的潛在作用因子，miR-451a-mimic能夠抑制AMP活化蛋白激酶對雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1的激活作用，從而達到調(diào)節(jié)腫瘤生長的目的。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，能對細胞外基質(zhì)成分進行降解，這種作用是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要條件[11-13]。MMP-2具有明膠酶的特性，可以在腫瘤浸潤時，分解細胞外基質(zhì)的通路，可以使細胞外基質(zhì)重新排列，加速腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移[14，15]。MMP-2的過度表達加強了惡性腫瘤的局部侵襲能力和遠端轉(zhuǎn)移能力，使病情進一步的惡化[16，17]。有研究顯示在結(jié)直腸癌病變組織中MMP-2表達升高，明顯異于正常的結(jié)直腸組織[18]。

有研究顯示在胃癌細胞中MMP-2蛋白表達量受到miR-451a表達的影響，但在結(jié)直腸癌中尚未有足夠的研究揭示這兩者的關(guān)系[19，20]，本實驗發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中miR-451a-mimic后發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達量相應(yīng)的減少，證明MMP-2的表達確實受到miR-451a的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-451a-mimic以及抑制MMP-2的表達均會抑制腫瘤細胞的增殖，同時還發(fā)現(xiàn)，將miR-451a-mimic和MMP-2同時轉(zhuǎn)染后，細胞增殖沒有抑制，說明MMP-2蛋白恢復(fù)表達時，miR-451a-mimic并不能抑制癌細胞的增殖，可知miR-451a抑制結(jié)直腸癌細胞生長依賴于MMP-2的表達。

總而言之，miR-451a和MMP-2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中均分別扮演了關(guān)鍵角色，但其中MMP-2和miR-451a兩者之間的相互關(guān)系及共同對腫瘤細胞的影響還未充分研究。本研究旨在探討miR-451a和MMP-2兩者在結(jié)直腸癌中共同發(fā)揮作用的聯(lián)系，以闡明miR-451a作為抑癌因子具體的功能機制，為腫瘤個體化治療提供幫助。本實驗只能證實miR-451a表達可以抑制MMP-2表達，其中具體的機制還需要進一步探索。

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（收稿日期：2019-12-19）