SPE-UPLC-MS/MS直接測(cè)定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

孫文閃，章虎，張安平，諸駿杰，余鵬飛，沈雄雅

1. 綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司（杭州 310051）；2. 浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院（杭州 310014）

草甘膦（Glyphosate，Gly）作為無(wú)選擇類(lèi)除草劑，以其高效、低毒、廉價(jià)等特性被廣泛運(yùn)用于全球各個(gè)農(nóng)業(yè)和非農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[1-2]。草甘膦在環(huán)境和生物體中富集并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)人體健康造成危害。隨著草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，其及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸（Aminom ethyl phosphonic acid，AMPA）殘留問(wèn)題也越來(lái)越受關(guān)注。GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)草甘膦的最大殘留量有如下規(guī)定：谷物0.1～0.5 mg/kg，水果0.1～0.5 mg/kg，茶葉1 mg/kg。草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸都具有易溶于水，難溶于一般有機(jī)溶劑，難揮發(fā)，缺少發(fā)色和熒光基團(tuán)等特性，因此運(yùn)用常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)比較困難[3]。目前，草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸檢測(cè)方法有氣相色譜（GC）法[4]、離子色譜（IC）法[5-8]、液相色譜（LC）法[9-10]、氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法[11]、液相色譜質(zhì)譜（LC-MSMS）法[12-17]、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）[18]等，但是這些方法大部分需要衍生反應(yīng)，時(shí)間長(zhǎng)甚至要過(guò)夜，操作程序繁瑣，穩(wěn)定性差，靈敏度低，有機(jī)試劑污染嚴(yán)重，難以直接運(yùn)用在食品樣品的檢測(cè)中。因此建立一種簡(jiǎn)單、便捷、有效的草甘膦及其代謝物殘留的檢測(cè)方法具有重要的意義。試驗(yàn)建立了SPEUPLC-MS/MS直接測(cè)定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的方法，該方法簡(jiǎn)便、快捷、有效，前處理步驟少，有機(jī)溶劑消耗量小，無(wú)需使用酸堿試劑調(diào)節(jié)pH，樣品無(wú)需衍生，結(jié)果穩(wěn)定性高，可滿(mǎn)足各類(lèi)食品的檢測(cè)需求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

LC30A液相色譜（日本島津公司）；ABSCIEX QTRAP 5500質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山舒美）；ST16R高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾公司）；EUFO-945616渦旋震蕩器（TALBOYS）；Milli-Q型超純水儀（美國(guó)密理博公司）；BSA224S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Oasis HLB固相萃取小柱（5 mL/200 mg，Waters公司）；0.22 μm水溶性濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；1 mL醫(yī)用注射器（島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司）；50 mL離心管（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

乙腈、二氯甲烷（色譜純，德國(guó)CNW科技公司）；乙酸銨（質(zhì)譜純，美國(guó)賽默飛世爾公司）；草甘膦以及氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，德國(guó)Dr Ehrenstofer公司）。樣品市售。

1.2 樣品前處理

提?。悍Q(chēng)取2 g（精確到 0.001 g）樣品于 50 mL聚丙烯離心管中，加入10.0 mL超純水，渦旋混合3 min，超聲提取20 min，再加入5 mL二氯甲烷，渦旋混合2 min，以 8 000 r/min離心 5 min，上清液待凈化。

凈化：取2 mL上清液，過(guò)HLB-SPE小柱凈化，HLB-SPE小柱先經(jīng)過(guò)5 mL的純水和5 mL甲醇活化，前1 mL上清液過(guò)柱，棄去不要，后1 mL過(guò)柱后收集，過(guò)0.22 μm水溶性濾膜，待上機(jī)。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱Waters BEH Amide氨基柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.25 mL/min；流動(dòng)相，A-乙腈，B-5 mmol/L乙酸銨溶液，氨水調(diào)節(jié)至pH 11，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫程序

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；氣簾氣流量40.0 psi；噴霧氣流量60.0 psi；輔助加熱氣流量60.0 psi；掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；監(jiān)測(cè)離子對(duì)見(jiàn)表2。

表2 草甘膦以及氨甲基膦酸的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取草甘膦以及氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解配制成200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在4 ℃下保存待用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：采用空白樣品（綠茶、大米、小麥粉、草莓、白蘿卜），經(jīng)1.2提取凈化，配制成5個(gè)不同濃度基質(zhì)標(biāo)樣（5.00～100 μg/L和10.0～200 μg/L），現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確立

草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸具有較強(qiáng)的極性，均具有易溶于水的特性，在水中能夠解離生成少量的氫離子，屬于較弱的有機(jī)酸，因此適合采用負(fù)離子源模式檢測(cè)，選擇ESI負(fù)離子模式對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸進(jìn)行母離子掃描（一級(jí)掃描），得到草甘膦和氨甲基膦酸的母離子，分別為167.8和109.9；然后再進(jìn)行子離子掃描（二級(jí)掃描），得到的草甘膦的子離子（62.8和81.0），氨甲基膦酸的子離子為62.8和78.9；再對(duì)這些離子對(duì)進(jìn)行碰撞電壓、去簇電壓、入口電壓和碰撞室出口電壓的優(yōu)化，得到最佳的響應(yīng)條件，見(jiàn)表2。最后對(duì)離子源溫度、噴霧電壓、氣簾氣流量、噴霧氣流量、輔助加熱氣流量進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的離子源參數(shù)：離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；氣簾氣流量40.0 psi；噴霧氣流量60.0 psi；輔助加熱氣流量60.0 psi。

2.2 液相條件的選擇

質(zhì)譜檢測(cè)雖然具有高的靈敏度和選擇性，但是對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸的強(qiáng)極性和易溶于水的物質(zhì)，需要選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相以及洗脫條件，使其具有尖銳對(duì)稱(chēng)的峰型和一定的分離度，才能發(fā)揮出質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)。常規(guī)的C18和T3等色譜柱對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸沒(méi)有保留，于是選擇HILIC模式色譜柱對(duì)其進(jìn)行分離，氨基柱是HILIC模式中的一種，在糖類(lèi)等碳水化合物分析中廣泛應(yīng)用[19-20]，于是嘗試用它來(lái)分析，氨基柱常用的流動(dòng)相是乙腈和水，由于草甘膦和氨甲基膦酸采用的是負(fù)離子模式，在流動(dòng)相中可以添加適當(dāng)濃度的氨水和乙酸銨來(lái)提高離子化效率而提高響應(yīng)，同時(shí)改善色譜峰的峰型，緩沖體系進(jìn)一步增加系統(tǒng)的穩(wěn)定性，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸銨的濃度為5 mmol/L，峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，又不會(huì)對(duì)檢測(cè)器造成太多的污染，故選擇5 mmol/L乙酸銨，當(dāng)乙酸銨的濃度為5 mmol/L時(shí)，再添加不同濃度的氨水調(diào)節(jié)乙酸銨溶液的pH，草甘膦和氨甲基膦酸的響應(yīng)與乙酸銨溶液pH的關(guān)系見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，pH越高，響應(yīng)越好，這是因?yàn)樵趬A性條件下，草甘膦和氨甲基膦酸更容易形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子，但是考慮Waters BEH Amide氨基柱pH上限，最終確定乙酸銨溶液的pH為11。同時(shí)梯度洗脫有助于降低基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)干擾，同時(shí)可有效減少雜質(zhì)對(duì)色譜柱的污染，獲得更好的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)，故選擇梯度洗脫。試驗(yàn)得到的最佳液相條件為：色譜柱Waters BEH Amide氨基柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流速0.25 mL/min，流動(dòng)相pH 11的5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。在該條件下進(jìn)樣分析，草甘膦和氨甲基膦酸基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖2，空白樣品的色譜圖見(jiàn)圖3，空白樣品添加回收的色譜圖見(jiàn)圖4。從圖2～圖4可以看出，優(yōu)化后的液相條件可以得到尖銳對(duì)稱(chēng)的峰型，無(wú)雜質(zhì)干擾，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量計(jì)算。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的峰面積與乙酸銨溶液的pH關(guān)系圖

圖2 草甘膦以及氨甲基膦酸基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液LC-MS-MS色譜圖

圖3 空白樣品的LC-MS-MS色譜圖

圖4 空白樣品添加回收的LC-MS-MS色譜圖

2.3 樣品的凈化

樣品用水提取后，首先通過(guò)二氯甲烷萃取除去脂溶性色素以及其他一些非極性雜質(zhì)，然后再用固相萃取小柱進(jìn)行凈化。Oasis HLB小柱的填料為親水親脂的反相吸附劑，可以有效去除蛋白質(zhì)、脂肪、色素等物質(zhì)，在抗生素[21]和激素[22]等檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，因此選擇Oasis HLB小柱作為凈化柱。分別將10.0和50.0 μg/L草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用HLB凈化，其回收率在93.8%～102%之間，說(shuō)明HLB小柱對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸沒(méi)有吸附，因此可以采取過(guò)濾式凈化模式，不需要清洗和洗脫步驟，操作簡(jiǎn)單。對(duì)茶葉提取液過(guò)柱前后成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)過(guò)柱后茶多酚減少了95.2%，咖啡因減少了93.6%，氨基酸減少了62.6%，說(shuō)明HLB小柱除了可以除去蛋白質(zhì)、脂肪、色素等大分子物質(zhì)，對(duì)一些小分子物質(zhì)也有較好的除去效果，因此采取Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.4 方法的檢出限、定量限、線性范圍

方法檢出限（LOD）的確定通過(guò)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)并不斷降低加標(biāo)濃度，進(jìn)樣分析信噪比為3，通過(guò)試驗(yàn)和分析得到草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別為10.0和20.0 μg/kg。定量限（LOQ）的確定通過(guò)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)并不斷降低加標(biāo)濃度，進(jìn)樣分析信噪比為10，并且回收率在70.0%以上，通過(guò)試驗(yàn)和分析得到定量限分別為25.0和50.0 μg/kg。在1.3儀器條件下，草甘膦以及氨甲基膦酸分別在5.00～100 μg/L和10.0～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，綠茶、大米、小麥粉、草莓、白蘿卜五種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度

方法的準(zhǔn)確度通過(guò)空白樣品添加回收試驗(yàn)的回收率來(lái)考察，添加濃度為定量限、2倍定量限和10倍定量限；精密度通過(guò)同一濃度平行添加6次回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)獲得，不同樣品基質(zhì)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯觯涸摲椒ㄖ胁莞熟⒑桶奔谆⑺嵩诟鞣N基質(zhì)中的回收率在72.0%～90.8%之間，精密度RSD值小于10.0%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范基本信息 食品理化檢測(cè)》中的回收率和精密度的要求。

表3 五種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)

表4 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 實(shí)際樣品測(cè)定

運(yùn)用此方法對(duì)市場(chǎng)上55份食品進(jìn)行檢測(cè)，其中茶葉樣品22份、大米9份、小麥粉5份、水果12份、蔬菜7份結(jié)果顯示，茶葉樣品檢出5份，含量在0.062～1.31 mg/kg之間；水果樣品中草莓檢出1份，含量為1.45 mg/kg；大米檢出1份，含量為0.064 mg/kg。該方法可以滿(mǎn)足GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)草甘膦的最大殘留量的規(guī)定，為食品中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂和制定提供借鑒意義。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)采用水提取，HLB小柱凈化，氨基色柱進(jìn)行分離，UPLC-MS/MS測(cè)定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸。該方法簡(jiǎn)便、快捷、有效，前處理步驟少，無(wú)需使用酸堿試劑調(diào)節(jié)pH，樣品無(wú)需衍生，結(jié)果準(zhǔn)確性好，可滿(mǎn)足各類(lèi)食品的檢測(cè)需求，具有一定的推廣價(jià)值。