HPLC-MS/MS法測(cè)定豬肉和雞肉中12種磺胺殘留

李湘利，劉靜，劉婉，王秋敏

1. 濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，濟(jì)寧市特色農(nóng)產(chǎn)品高值化加工工程技術(shù)研究中心（曲阜 273155）；2. 山東嘉源檢測(cè)技術(shù)有限公司，濟(jì)寧市食品安全云檢測(cè)工程技術(shù)研究中心（濟(jì)寧 272100）

磺胺類(lèi)藥物（Sulfonamides，SAs）是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的藥物總稱(chēng)，多有顯著的抗菌活性[1]，是治療尿路感染、耳部感染、支氣管炎、皮膚和軟組織感染的重要抗生素，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域[2]。通過(guò)任何途徑攝入的磺胺類(lèi)藥物都會(huì)在人體中蓄積，導(dǎo)致機(jī)體過(guò)敏、造血紊亂、泌尿系統(tǒng)損害等[3]?；前奉?lèi)藥物常用分析方法有高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜（GC）法、高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法、酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法、生物傳感器免疫分析（BIA）法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法、氣相色譜質(zhì)譜（GC/MS）法、超臨界流體色譜（SFC）法和微生物法等[4]。其中，HPLC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，用于復(fù)雜樣品分析檢測(cè)，可省去分離純化代謝物樣品的繁瑣步驟[5]；根據(jù)藥物原型成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可迅速推測(cè)并確定待測(cè)成分的結(jié)構(gòu)信息，分析鑒定痕量成分[6]。

豬肉和雞肉是最為常見(jiàn)的動(dòng)物性食品原料之一，其磺胺類(lèi)藥物殘留易在人體內(nèi)蓄積[7]。為此，試驗(yàn)以豬肉、雞肉為材料，參照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定液相色譜串-聯(lián)質(zhì)譜法》中磺胺獸藥殘留量的測(cè)定方法[8]，測(cè)定豬肉和雞肉中12種磺胺類(lèi)藥物殘留量，旨在建立一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適于豬肉、雞肉中磺胺類(lèi)藥物殘留的測(cè)定方法，明確磺胺類(lèi)藥物殘留差別，為開(kāi)展磺胺類(lèi)藥物殘留檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、雞肉，山東嘉源檢測(cè)技術(shù)有限公司樣品室提供。

乙腈（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、正乙烷（高效液相色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磺胺醋酰（Sulphacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（Sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDM）、磺胺甲氧噠嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）、磺胺-6-甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine，SMD）、磺胺氯噠嗪（Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲基異噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ），純度≥99%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260-6460-C液相質(zhì)譜儀，安捷倫（中國(guó)）有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；均質(zhì)器，德國(guó)IKA/艾爾；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；XH-C旋渦混合器，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；XY200-2C電子天平，常州幸運(yùn)電子有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用空白樣品提取液配成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為10，20，40，60，80，100和200 ng/mL，儲(chǔ)備液和工作液均于4 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理[8]

25個(gè)豬肉樣品編號(hào)為Z-1～Z-25；25個(gè)雞肉樣品編號(hào)為J-1～J-25，樣品于-18 ℃冷凍保存。將豬肉和雞肉樣品攪碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g，置于50 mL離心管中，加入20 g無(wú)水硫酸鈉和20 mL乙腈，均質(zhì)2 min，再以3 000 r/min離心3 min。上清液轉(zhuǎn)入100 mL圓底燒瓶中，殘?jiān)偌尤?0 mL乙腈，均質(zhì)2 min，再以3 000 r/min離心3 min，合并上清液，向圓底燒瓶中加入10 mL異丙醇；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于50 ℃水浴蒸干，準(zhǔn)確加入1 mL正乙烷和1 mL流動(dòng)相（乙腈+0.01 mol/L的乙酸銨溶液，12+88）溶解燒瓶中的殘?jiān)?。轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，旋渦混合1 min，以3 000 r/min離心3 min，棄上層正乙烷，再加入1 mL正乙烷，重復(fù)上述步驟，直至下層水相為透明液體。另稱(chēng)取7份5.00 g空白豬肉樣品，分別添加1 mL 10，20，40，60，80，100和200 ng/mL磺胺類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品前處理方法制備空白提取液，下層清液過(guò)0.2 μm濾膜，即得上機(jī)待測(cè)液。

1.3.3 色譜和質(zhì)譜條件[9]

液相色譜條件：Lichrospher 100RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量40 μL；流動(dòng)相為乙腈和0.01 mol/L乙酸銨溶液；流速0.8 mL/min；分流比1∶3。

質(zhì)譜條件：電子源為電噴霧離子源；離子源溫度350 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓0.076 MPa；氣簾氣壓力0.069 MPa；輔助氣流6 L/min；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。12種磺胺類(lèi)藥物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 12種磺胺類(lèi)藥物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓

1.3.4 HPLC-MS/MS法測(cè)定

用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣，以工作溶液濃度（10，20，40，60，80，100和200 ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品添加色譜圖

在設(shè)定的條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析，12種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)樣品（100 ng/mL）的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，12種磺胺類(lèi)藥物分離效果較好，無(wú)明顯色譜雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍

測(cè)定12種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度均為10，20，40，60，80，100和200 ng/mL），以峰面積（Y）和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）作圖，結(jié)果見(jiàn)表2。在10～200 ng/mL范圍內(nèi)，各磺胺類(lèi)藥物的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r在0.997 3～0.999 7之間，均在0.997 3以上。

圖1 12種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

表2 12種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 方法檢出限

對(duì)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度作為方法定量限（LOQ）[10]。豬肉、雞肉空白基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在多次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)基礎(chǔ)上將12種磺胺類(lèi)藥物的方法檢出限定為2 μg/kg，將定量限定為10 μg/kg，遠(yuǎn)低于歐、美、日等國(guó)家設(shè)定的殘留最大限量[11]，說(shuō)明HPLC-MS/MS法可提高定量分析的選擇性和靈敏度，檢出限較低，滿(mǎn)足分析要求。

2.4 保留時(shí)間

12種磺胺類(lèi)藥物不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量結(jié)果見(jiàn)表3。由空白豬肉樣品10，20，40，60，80，100和200 ng/mL（L1～L7）的保留時(shí)間可知，各水平下磺胺類(lèi)藥物保留時(shí)間相差不超過(guò)0.02 min，出峰時(shí)間穩(wěn)定，表明色譜操作條件穩(wěn)定，可作為定性分析依據(jù)。12種磺胺類(lèi)藥物從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值的時(shí)間分別為磺胺醋酰2.49 min、磺胺嘧啶3.05 min、磺胺噻唑3.44 min、磺胺吡啶3.63 min、磺胺甲基嘧啶3.85 min、磺胺甲噻二唑4.44 min、磺胺二甲嘧啶4.50 min、磺胺甲氧噠嗪4.58 min、磺胺-6-甲氧嘧啶4.58 min、磺胺對(duì)甲氧嘧啶4.59 min、磺胺氯噠嗪5.21 min、磺胺甲基異噁唑5.57 min。

表3 12種磺胺類(lèi)藥物在不同添加水平下的保留時(shí)間

2.5 方法的回收率

豬肉和雞肉的空白基質(zhì)分別加入2，8和20 μg/kg的低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品前處理方法進(jìn)行前處理以評(píng)價(jià)加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。結(jié)果表明，豬肉樣品空白基質(zhì)中12種磺胺化合物3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為94.2%～133.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.07%～6.11%；雞肉樣品空白基質(zhì)的平均回收率為89.1%～112.2%，RSD為2.46%～5.87%。這說(shuō)明使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)進(jìn)行校正，可消除基質(zhì)效應(yīng)影響，對(duì)豬肉和雞肉中12種磺胺類(lèi)藥物殘留的測(cè)定有良好的準(zhǔn)確度，符合殘留分析要求。

表4 豬肉樣品的添加回收率

表5 雞肉樣品的添加回收率

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取25個(gè)豬肉樣品和25個(gè)雞肉樣品測(cè)定12種磺胺類(lèi)藥物的殘留量，結(jié)果見(jiàn)表6。各樣品的磺胺類(lèi)藥物的殘留量相對(duì)較低，殘留量低于農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定的動(dòng)物組織磺胺類(lèi)藥物殘留限量100 μg/kg[12]；25份豬肉樣品中有3份樣品被檢出磺胺類(lèi)藥物殘留，其余樣品未檢出，豬肉樣品中被檢測(cè)出的4種磺胺類(lèi)藥物分別為磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶；25份雞肉樣品中有1份樣品被檢出磺胺嘧啶藥物殘留，其余未測(cè)出；所有豬肉和肌肉樣品的磺胺類(lèi)藥物殘留均未超標(biāo)，殘留量均合格。

表6 樣品中磺胺類(lèi)藥物殘留檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

采用GB/T 20759—2006液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉和雞肉中12種磺胺類(lèi)藥物殘留，該法在10～200 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r高于0.997 3，方法檢出限為2 μg/kg，定量限為10 μg/kg；豬肉和雞肉樣品空白基質(zhì)中12種磺胺藥物3個(gè)加標(biāo)水平（2，8和20 μg/kg）的平均回收率分別為94.2%～133.4%和89.1%～112.2%，RSD分別為2.07%～6.11%和2.46%～5.87%。豬肉中的磺胺類(lèi)藥物殘留被檢測(cè)出的樣品份數(shù)高于雞肉的檢出份數(shù)，被檢測(cè)的12種磺胺類(lèi)藥物，磺胺嘧啶殘留被檢出，其次是磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶。豬肉樣品中的磺胺類(lèi)藥物檢出率為12%，雞肉樣品中的磺胺類(lèi)藥物檢出率為4%。所檢試樣的磺胺類(lèi)藥物殘留量均未超標(biāo)，符合國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告）規(guī)定。GB/T 20759—2006中的方法可對(duì)豬肉和雞肉中的磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行定性和定量分析，具有回收率與準(zhǔn)確度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可滿(mǎn)足檢測(cè)和監(jiān)管需求。