GC-MS/MS法測定水果、蔬菜中敵草快的殘留量

陳盧濤，朱萌萌，劉小羽，黎斌，俞璐萍，杜啟偉

1. 綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司（杭州 310000）；2. 浙江工業(yè)大學(xué)（杭州 310000）

敵草快（Diquat dibromide），是在1955年由英國ICI公司開發(fā)的一種聯(lián)吡啶類除草劑，對闊葉雜草有很強的防除能力，被廣泛應(yīng)用于水生雜草的防除[1]。敵草快作為一種水溶性非常大的農(nóng)藥，由于其良好的除草催枯作用，近年來從旱地作物轉(zhuǎn)向水稻等作物上大規(guī)模使用[2]。楊亞哲等[3]研究表明，敵草快通過干擾植物細(xì)胞膜，破壞光合作用，對藻類和溞類具有急性毒性；鮑偉光等[4]研究表明，敵草快可對育肥豬腸道造成嚴(yán)重?fù)p傷并減弱腸道的消化功能。

國內(nèi)外對敵草快農(nóng)藥的檢測分析方法主要包括氣相色譜（GC-FID）法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜[7-9]（GCMS）法、液相色譜（HPLC）法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[11-12]、毛細(xì)管電泳色譜法[13]、表面增強拉曼散射（SERS）法[14-15]。由于敵草快以季銨鹽類形式存在，具有很強的極性，難揮發(fā)，因而很少直接用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法測定，需要先進(jìn)行衍生化將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性化合物。試驗擬采用5%的氯化鎳溶液作為催化劑，比較硼氫化鈉和硼氫化鉀用于敵草快衍生化反應(yīng)的優(yōu)劣，并結(jié)合GC-MS/MS方法，探究一種操作簡便、試驗成本低、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的方法，用于水果、蔬菜中敵草快殘留量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵草快標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；硼氫化鈉、硼氫化鉀（含量≥97.0%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（含量≥99.0%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；六水合氯化鎳（5%水溶液，取5 g溶解到100.0 mL去離子水，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；中性氧化鋁（100～200目，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（色譜純，美國J.T. Baker公司）；試驗所用水均為去離子水；微孔有機濾膜（0.22 μm）。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 plus氣相色譜儀配TQ 8040質(zhì)譜儀，VF-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本Shimadzu公司）；BSA2202S電子天平（德國Sartorius公司）；漩渦混合器（美國Henry Troemner公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ST-16R離心機（美國Thermo Fisher公司）；CHK-121臺式精密酸度計（北京昌科儀自動化科技有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度，250 ℃；載氣，高純氦氣；碰撞氣，高純氬氣，純度≥99.999%；柱流量1.0 mL/min；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣，1.0 min后開閥；進(jìn)樣量，1 μL；定量方法，外標(biāo)法。升溫程序：80 ℃保持0 min，以40 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

色譜-質(zhì)譜接口溫度，280 ℃；電離方式，EI；電離能量，70 eV；離子源溫度，230 ℃；檢測器電壓，0.98 kV（+0.4 kV）；測定方式，MRM多重反應(yīng)監(jiān)測模式；定量、定性離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 敵草快質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.4 試驗步驟

1.4.1 提取

稱取2.00 g（精確至0.01 g）蔬菜或水果樣品于15 mL離心管中，加入4.0 mL純凈水浸泡0.5 h，渦旋器振蕩3.0 min，超聲提取30 min，待衍生。

1.4.2 衍生化

向上述提取液中加入0.5 mL催化劑5%的氯化鎳溶液，蓋上瓶蓋，渦旋0.5 min，加入20 mg硼氫化鈉，過程中會產(chǎn)生大量氣泡，應(yīng)小心操作，防溢出。再次蓋上瓶蓋，渦旋0.5 min，放入85 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)25 min，冷卻至室溫后待凈化。

1.4.3 凈化

向上述衍生液中加入0.5 g中性氧化鋁，渦旋3 min，準(zhǔn)確加入1.0 mL正己烷后再次渦旋3 min，以8 000 r/min下離心3.0 min，取上清液，加入0.1 g無水硫酸鈉后過膜，供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.010 0 g敵草快，用去離子水定容至25.0 mL，分別得到約400 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；用去離子水稀釋為50.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于0～4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電子轟擊離子源（EI）檢測模式下對敵草快進(jìn)行一級質(zhì)譜分析（Q3 Scan）。在質(zhì)譜圖中選擇質(zhì)荷比較大，絕對強度較大的離子為前體離子；設(shè)定3～45 eV（每3 eV一個間隔）的碰撞能量，對選定的前體離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析（產(chǎn)物離子掃描），根據(jù)二級質(zhì)譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子，離子強度次之的為定性離子。敵草快經(jīng)硼氫化鈉/氯化鎳還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為沸點較低的物質(zhì)1, 1-乙基-2, 2-聯(lián)哌啶。經(jīng)觀察，該物質(zhì)存在順反同分異構(gòu)體，在串級質(zhì)譜上會出現(xiàn)兩個峰，且3個離子對比率相似，雖與GB/T 5009.221—2008《糧谷中敵草快殘留量的測定》中出現(xiàn)單峰不同，但與高利娜等[9]采用固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法測定血漿中敵草快的結(jié)果一致，圖1為使用優(yōu)化后的氣相色譜質(zhì)譜條件采集敵草快（100 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM質(zhì)譜圖。

圖1 敵草快MRM色譜圖

2.2 衍生化試劑的選擇

敵草快具有較高的沸點（＞300 ℃）和一定的極性，通常需要衍生化反應(yīng)后再進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，試驗比較硼氫化鈉和硼氫化鉀2種衍生化試劑對敵草快衍生化反應(yīng)的效率和適宜性。

在15 mL離心管中加入20.0 μL 50.0 mg/L敵草快標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別添加5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0和60.0 mg 2種衍生化試劑，在常溫條件下，按照1.4.2的衍生化方法進(jìn)行衍生30 min，并將最終體積定容為1.0 mL上機分析。結(jié)果表明（見圖2），隨著硼氫化鈉添加量增加，敵草快衍生化產(chǎn)物響應(yīng)逐漸提高，添加量增加到10.0 mg時，衍生化產(chǎn)物含量呈穩(wěn)定趨勢。隨著硼氫化鉀添加量增加，敵草快衍生化產(chǎn)物響應(yīng)逐漸提高，添加量增加到10.0 mg時，衍生化產(chǎn)物含量呈穩(wěn)定趨勢。為保證衍生化反應(yīng)完全，選擇硼氫化鈉和硼氫化鉀的添加量20.0 mg，且此時兩者衍生化合物含量也趨于一致。綜合考慮試驗成本及衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)，選擇硼氫化鈉添加量20.0 mg。

圖2 2種衍生化試劑添加量對衍生化效率的影響比較

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

2.3.1 衍生溫度的選擇

敵草快在不同衍生溫度下衍生效率差別較大，試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生時間30 min，正己烷為提取溶劑，比較不同衍生溫度的衍生效率。稱取1.0 g蘋果樣品，添加20.0 μL 50.0 mg/L敵草快標(biāo)準(zhǔn)工作液和4.0 mL去離子水，通過衍生和提取，比較不同溫度條件下的衍生效率。結(jié)果表明（見圖3），敵草快受不同衍生溫度影響較大，隨著溫度增大，衍生效率逐漸提高。溫度增加到80 ℃時，衍生化產(chǎn)物含量呈穩(wěn)定趨勢。綜合考慮，選擇80 ℃為最佳衍生溫度。

圖3 溫度對衍生效果的影響

2.3.2 衍生時間的選擇

敵草快在不同衍生時間下衍生效率差別較大，試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生溫度80 ℃，正己烷為提取溶劑，比較不同衍生時間的衍生效率。稱取1.0 g蘋果樣品，添加20.0 μL 50.0 mg/L的敵草快標(biāo)準(zhǔn)工作液和4.0 mL去離子水，通過衍生和提取，比較不同衍生時間下的衍生效率。結(jié)果表明（見圖4），敵草快受不同衍生時間影響較大，隨著時間延長，衍生效率逐漸提高。時間增加到25 min時，衍生化產(chǎn)物含量呈穩(wěn)定趨勢。綜合考慮，選擇最佳衍生時間25 min。

圖4 時間對衍生效果的影響

2.3.3 凈化試劑的選擇

敵草快在衍生化后產(chǎn)生大量黑色物質(zhì)，對儀器分析產(chǎn)生較大干擾。試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生溫度80 ℃，衍生時間25 min，正己烷為提取溶劑，考察中性氧化鋁的凈化效果。稱取1.0 g蘋果樣品，添加4.0 mL去離子水，衍生后加入0.5 g中性氧化鋁，渦旋3 min后加入1 mL正己烷提取，比較凈化前后的總離子流圖情況。結(jié)果表明（見圖5），中性氧化鋁有較好的凈化效果。

圖5 凈化前后總離子流圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（ME）指樣品中除分析物以外的其它成分對待測物測定值的影響，即基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確測定分析物能力的干擾。試驗前處理衍生過程產(chǎn)生大量黑色物質(zhì)，可能對目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生一定的影響，按照Stahnke中的添加法定量評價基質(zhì)效應(yīng)強度，分別測定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑酉嗤瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強度，考察在添加1.00 mg/kg條件下，不同基質(zhì)條件對敵草快響應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。

式中：Pm為基質(zhì)加標(biāo)峰面積；Ps為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。

敵草快在蘿卜樣品中存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，在其他基質(zhì)中均存在基質(zhì)增強效應(yīng)，這與已知的氣相色譜分析中大多數(shù)農(nóng)藥表現(xiàn)出不同程度的基質(zhì)增強效應(yīng)論點相吻合。敵草快在蘋果和辣椒中的基質(zhì)增強效應(yīng)均比其它基質(zhì)要強，可能與蘋果基質(zhì)中含有較多的糖分、辣椒基質(zhì)中含有較多的辣椒素有關(guān)，在前處理過程中未得到有效凈化。在基質(zhì)效應(yīng)存在情況下，試驗選取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，可以一定程度上降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.5 方法的線性范圍、加標(biāo)回收率、精密度和定量限

取0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/L 5個質(zhì)量濃度的敵草快，按優(yōu)化色譜條件進(jìn)樣1 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限（LOD），S/N≥10估算儀器的定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

稱取市售的柚子、青菜、火龍果、百香果、柑橘、土豆、蘋果、花菜、辣椒、蘿卜10個樣品，分別添加20，50和100 μg/kg不同水平的敵草快標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗，每個添加水平重復(fù)3次，加標(biāo)回收結(jié)果見表3。敵草快的平均回收率為73.9%～92.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.4%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認(rèn)的要求。

圖6 不同基質(zhì)對敵草快的基質(zhì)效應(yīng)影響（n=3）

接表3

3 結(jié)論

試驗比較硼氫化鈉、硼氫化鉀2種衍生化試劑用于敵草快衍生化反應(yīng)的優(yōu)劣，2種衍生化試劑均可用于敵草快的衍生化反應(yīng)檢測，敵草快經(jīng)硼氫化鈉或硼氫化鉀衍生后，會產(chǎn)生同分異構(gòu)體2個峰，采用峰面積加和的方式參與計算，定量更準(zhǔn)確。對敵草快在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行探討，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量可以有效降低基質(zhì)效應(yīng)。采用優(yōu)化后的GCMS/MS方法，在空白樣品添加濃度0.02，0.05和0.10 mg/kg不同水平的敵草快標(biāo)準(zhǔn)溶液，敵草快的平均回收率為71.3%～95.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.4%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認(rèn)的要求。因此優(yōu)化后的方法操作簡便，分析速度快，抗干擾能力強，適用于水果、蔬菜中敵草快的定性、定量檢測。