液液萃取-HPLC法測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1

馬海峰，陶唐平，方林明，劉成林，單平平，陳輝德*

安徽中創(chuàng)食品檢測(cè)有限公司（蕪湖 241000）

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的有20余種，確定結(jié)構(gòu)的有17種[1-2]。黃曲霉毒素極易污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米及大米等，在眾多黃曲霉毒素中以黃曲霉毒素B1分布最為廣泛，并且是毒性最強(qiáng)的一種，被確認(rèn)為I類致癌物[3-7]。多數(shù)國(guó)家非常重視黃曲霉毒素B1防控，并制定食品中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)[8-11]。

食品中黃曲霉毒素B1常用的檢測(cè)方法有薄層色譜（TLC）法、酶聯(lián)免疫（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法[12-20]等。TLC是檢測(cè)黃曲霉毒素B1的經(jīng)典方法，但前處理繁瑣，易受雜質(zhì)干擾并且定量起來(lái)較為困難。ELISA法檢測(cè)過(guò)程比較簡(jiǎn)便，但有可能產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，檢測(cè)準(zhǔn)確度有待提高。HPLC-MS法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，檢出限低，但儀器價(jià)格昂貴，不易普及。因此通常采用HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素B1。

HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素B1過(guò)程中，為了排除提取液中的雜質(zhì)對(duì)分離和檢測(cè)干擾，需要采用免疫親和柱[19-20]或?qū)Ｓ霉滔噍腿≈鵞21]凈化，成本較高。試驗(yàn)基于液液萃取對(duì)提取液進(jìn)行凈化，并考察流動(dòng)相組成和提取溶劑比例對(duì)結(jié)果的影響，驗(yàn)證不同基質(zhì)的加標(biāo)回收率和精密度；建立一種操作方便，靈敏度好，準(zhǔn)確性高的黃曲霉毒素B1高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

液相色譜儀配熒光檢測(cè)器（LC-20A，SHIMADZU）；電子分析天平（ME-204，METTLER TOLEDO）；超聲波清洗機(jī)（KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（Lab dancer，IKA）；氮吹儀（N1，上海屹堯科技有限公司）；均質(zhì)器（T25，IKA）；超純水機(jī)（Milli-Q，Millipore）；高速離心機(jī)（TDZ5-WS，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；有機(jī)系濾頭（0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈、三氯甲烷、正己烷（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3 μg/mL，美國(guó)o2si標(biāo)準(zhǔn)品公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、碘（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；流動(dòng)相用水（GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水）。

1.2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的配制

用初始流動(dòng)相將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，最終得到0.1，0.5，2.5，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3 色譜條件

Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，體積比）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量50 μL；柱后衍生系統(tǒng)（衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速0.2 mL/min；衍生反應(yīng)管溫度70 ℃）；熒光檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm）。

1.4 樣品的預(yù)處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取5 g左右試樣于50 mL塑料離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（85∶15，V/V）混合提取液，渦旋混勻1 min后，水浴超聲30 min。冷卻至室溫后，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和2 mL乙酸鋅溶液（183 g/L），混勻后靜置10 min。于離心機(jī)中以5 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。于殘?jiān)屑尤?.0 mL上述提取液，重復(fù)提取1次，合并2次提取液于同一25 mL容量瓶中，并定容至刻度。（液體樣品直接加乙腈定容至25 mL）。

1.4.2 凈化與濃縮

準(zhǔn)確吸取5.0 mL上清液，加入5 mL正己烷，渦旋2 min后棄去上層溶液（如產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可于離心機(jī)中4 000 r/min離心5 min）。于上述溶液中加入5 mL三氯甲烷，充分渦旋3 min，以5 000 r/min離心10 min，將三氯甲烷層轉(zhuǎn)移到另一離心管中。重復(fù)萃取1次，合并2次萃取液于60 ℃水浴中氮吹至干。用初始流動(dòng)相復(fù)溶并定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后以備測(cè)定。

1.4.3 測(cè)定

將凈化后的樣液注入液相色譜儀中，在與標(biāo)準(zhǔn)系列工作液相同的儀器條件下測(cè)定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法比較定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

采用的凈化方式是液液萃取，相比于免疫親和柱或?qū)Ｓ霉滔噍腿≈鶃?lái)說(shuō)，液液萃取凈化法得到的凈化液中可能會(huì)殘留一些雜質(zhì)，從而對(duì)檢測(cè)造成干擾[22-23]。為滿足實(shí)際檢測(cè)需求，通過(guò)考察甲醇、乙腈與水之間不同比例組成，并結(jié)合檢測(cè)效率最終確定以甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，體積比）作為流動(dòng)相，等度洗脫且流速設(shè)置為1.0 mL/min。圖1為此流動(dòng)相條件下的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作液色譜圖。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作液色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將1.2中的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。在0.1～50 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性回歸方程為y=74 178.3x-7 972.1，擬合系數(shù)為0.999 97。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算儀器檢出限，結(jié)合檢測(cè)前處理過(guò)程計(jì)算黃曲霉毒素B1的方法檢出限為0.02 μg/kg。

圖2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品的前處理探究

2.3.1 提取溶劑的選擇

黃曲霉毒素B1易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等溶劑，通常采用含有一定比例甲醇或乙腈水溶液提取樣品中的黃曲霉毒素B1。以空白花生樣品為基質(zhì)（加標(biāo)量20 μg/kg），選用乙腈-水作為提取溶劑，分別探究不同比例的乙腈-水（90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，60∶40和50∶50，體積比）對(duì)目標(biāo)物提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。乙腈與水體積比85∶15時(shí)，提取率最高為85.6%。

圖3 不同比例的乙腈-水提取液對(duì)花生樣品中黃曲霉毒素B1的提取率比較

2.3.2 凈化方式的選擇

提取液中黃曲霉毒素B1常用的凈化方法有免疫親和柱法[19-20]，專用固相萃取柱法[21]和液液分配法[22-23]等。前兩者雖凈化效果優(yōu)越，但耗時(shí)長(zhǎng)，價(jià)格高，有一定局限性。因此試驗(yàn)采用液液分配法進(jìn)行凈化，在提取液中加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅除去蛋白質(zhì)，加入正己烷進(jìn)行渦旋，分離脂溶性雜質(zhì)。在樣液中添加三氯甲烷進(jìn)行目標(biāo)物的萃取，濃縮、定容，采用柱后碘衍生-高效液相色譜熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。從圖4可以看出，色譜圖背景干凈，花生樣品本底無(wú)目標(biāo)峰，加標(biāo)樣中目標(biāo)峰與雜峰分離明顯，說(shuō)明液液萃取有較好的凈化作用。液液分配法可以凈化的特點(diǎn)主要有：提取液中加入蛋白沉淀劑可以除去提取液中的蛋白質(zhì)；黃曲霉毒素B1難溶于正己烷，利用這一特性可以加入正己烷除去脂溶性雜質(zhì)；黃曲霉毒素B1易溶于三氯甲烷，加入三氯甲烷后利用分配系數(shù)的差異將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移到三氯甲烷中，起到進(jìn)一步凈化作用。

圖4 花生空白樣品及加標(biāo)樣品色譜圖

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)及精密度測(cè)定

取花生、玉米、黃豆、大豆油、醬油、腐乳、辣椒、嬰幼兒米粉等不同基質(zhì)的樣品，分別加入低（0.4 μg/kg）、中（4.0 μg/kg）、高（40 μg/kg）濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按上述方法檢測(cè)，各基質(zhì)樣品中的黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可得，所選的樣品本底中黃曲霉毒素B1都未檢出；加標(biāo)量0.4，4.0和40 μg/kg時(shí)，回收率范圍分別為75.9%～89.6%，78.5%～90.4%和82.1%～94.7%；每個(gè)加標(biāo)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為1.1%～5.4%，0.5%～5.2%和0.1%～1.8%。由此可見(jiàn)，該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好，能滿足分析測(cè)試要求。

表1 不同基質(zhì)中加標(biāo)回收率和精密度分析（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立一種簡(jiǎn)單快速的測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1方法，樣品提取液經(jīng)液液萃取凈化、濃縮及定容后，用柱后碘衍生-高效液相色譜檢測(cè)。利用該法對(duì)花生、玉米及黃豆等8種樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明方法無(wú)明顯雜質(zhì)干擾，并且準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。此方法與傳統(tǒng)高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B1相比，操作方便，靈敏度好，準(zhǔn)確性高，成本低廉，可推廣用于食品中黃曲霉毒素B1檢測(cè)。