多酚氧化酶的分離純化及生理功能的研究進(jìn)展

韓倩云，王坤立，溫馨，王笑園，吳嘉斕，倪元穎*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）；2. 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心（北京 100083）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一類廣泛存在于動物、植物、細(xì)菌和真菌體內(nèi)的銅結(jié)合酶，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、廢水處理等領(lǐng)域有著重要應(yīng)用。在有氧的條件下，多酚氧化酶能將組織中內(nèi)源性酚類物質(zhì)氧化成鄰醌，醌類物質(zhì)聚合并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)合，形成黑色或褐色物質(zhì)從而導(dǎo)致組織褐變[1]。除此之外，多酚氧化酶能夠保護(hù)生物體免受生物和非生物脅迫[2]。由于多酚氧化酶基因家族及其表達(dá)的復(fù)雜性，使得不同來源及同一品種不同類型多酚氧化酶的性質(zhì)差異顯著。擬綜述多酚氧化酶的分離提取方法，比較不同來源PPO的生理特性，以期為深入研究多酚氧化酶與酶促褐變提供參考。

1 PPO的來源與功能

多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要內(nèi)源性酶，細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶是一種質(zhì)體酶，存在于正常細(xì)胞的光合組織（如葉綠體內(nèi)囊體的囊泡）和非光合組織質(zhì)體中（如馬鈴薯塊莖細(xì)胞的造粉體）[3-4]。植物在細(xì)胞質(zhì)中合成PPO前體，通過兩個步驟將PPO運(yùn)輸?shù)饺~綠體中，首先依靠N末端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽將高分子量的PPO導(dǎo)入葉綠體基質(zhì)，利用基質(zhì)肽酶將轉(zhuǎn)運(yùn)肽切除，隨后依賴光的作用將PPO導(dǎo)入類囊體中成為一個較低分子量的成熟酶蛋白[5-7]。所有位于葉綠體內(nèi)PPO的特征是前體蛋白必須含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽，通過基質(zhì)肽酶的切除，以使PPO到達(dá)葉綠體中的指定位置并進(jìn)行表征[8]。大量研究表明，前體和成熟態(tài)PPO的分子量分別約為68和60 kDa，其比例受到植物的種類、年齡和生長條件等多種因素的影響[6]。褐變通常是由多酚氧化酶引起的，隨后是由衰老、損傷、病蟲害和病原體的侵襲造成細(xì)胞損傷。多酚氧化酶通過兩個氧化步驟將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為鄰醌，第一步是現(xiàn)有的羥基發(fā)生鄰位羥基化（“單酚氧化酶”或“單酚酶”活性，也稱為羥化酶或甲酚酶活性），第二步是鄰二羥基苯氧化為鄰苯醌（“二酚氧化酶”或“二酚酶活性”，也稱為兒茶酚酶或氧化酶活性）[6,9]。根據(jù)特定底物及其作用機(jī)理，多酚氧化酶可分為三類：酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。酪氨酸酶具有甲酚酶和兒茶酚酶活性；兒茶酚酶也稱為雙酚氧化酶，能將鄰二酚催化氧化為鄰醌；漆酶則通過自由基催化反應(yīng)機(jī)制氧化一系列芳香族化合物。多酚氧化酶一般是指兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱[1]。當(dāng)植物體受到外界壓力、傷害、病原體或食草動物侵襲時(shí)，也可以誘導(dǎo)PPO的活動水平[10-12]。

2 PPO的提取和純化

基于酶活性、純化倍數(shù)、蛋白濃度和酶的應(yīng)用，產(chǎn)生了一系列的分離純化方法。在大多數(shù)的研究中，一般采用鹽沉淀法、溫度誘導(dǎo)分離法和色譜法對PPO進(jìn)行提取和純化。三相分離、雙水相萃取、等電點(diǎn)沉淀法、圓盤電泳等新方法也被逐漸采用。以下列出的大多數(shù)方法都與酶的提取效率相關(guān)。

2.1 表面活性劑的使用

表面活性劑可以在水溶液中加速膠束的形成，膠束具有疏水性核心區(qū)域，可用于大部分酚類、脂類、單寧類和非極性蛋白質(zhì)的提取[9]。在粗酶液的提取中，Triton X-114是最常見的一種非離子表面活性劑，它不僅提供一個溫和的蛋白溶解環(huán)境而且避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性。通過后續(xù)的離心步驟可以清除表面活性劑，親水性蛋白也能被快速分離。如表1所示，添加1.5%～4%的Triton X-114或Triton X-100可以提高純化倍數(shù)，提取效率與表面活性劑的電荷和疏水性指數(shù)有關(guān)[13-16]。非離子型表面活性劑如Triton X-114具有較低的疏水性指數(shù)，與離子型表面活性劑相比效率更高[17]。添加表面活性劑的提取方法不僅工藝簡單、耗時(shí)短，還可以最大限度地去除酚類物質(zhì)來提高PPO的穩(wěn)定性。

雙水相萃取和三相分離法作為一種簡單經(jīng)濟(jì)的操作方法，可同時(shí)進(jìn)行生物大分子的提取和純化[18]。雙水相萃取是以水溶性聚合物、鹽-聚合物或鹽-醇的方式形成不同的兩相，三相分離法是將硫酸銨等鹽類和丁醇等水溶性醇類物質(zhì)添加到提取液中形成三相[19]。這兩種方法在PPO的分離中可以提高純化效率，但是提取過程中聚合物不能被很好地回收利用，在PPO分離純化的相關(guān)文獻(xiàn)中很少被報(bào)道[20]。

表1 表面活性劑對不同來源PPO提取的影響

2.2 溶劑沉淀法

溶劑法的目的是用于沉淀蛋白。常用的有機(jī)溶劑有乙醇和丙酮，該方法直接應(yīng)用于勻漿混合物。有機(jī)溶劑能將PPO從不同緩沖液中分離出來，由于它們會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化且通常需要在非常低的溫度下（-20 ℃）進(jìn)行[21]，所以有機(jī)溶劑沉淀法的應(yīng)用范圍有限。硫酸銨鹽是目前最常用的蛋白質(zhì)沉淀劑[22-24]。蛋白質(zhì)表面有親水和疏水區(qū)域，過量添加硫酸銨鹽會增加其表面張力從而增加蛋白質(zhì)的疏水相互作用，使其發(fā)生沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用[25]。不同分子量大小的蛋白質(zhì)所需的硫酸銨沉淀濃度不同，大多數(shù)研究結(jié)果表明50%～85%的硫酸銨鹽濃度用于提取PPO的效果最佳[26-30]（表2）。鹽析作用雖然會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，但不會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。為了保持酶活性，提取過程通常是在較低（4 ℃）溫度條件下進(jìn)行的，后續(xù)的試驗(yàn)中可通過添加SDS來提高酶活性[13]。

表2 硫酸銨沉淀對不同來源PPO提取的影響

2.3 色譜法

蛋白質(zhì)分子由于自身性質(zhì)的特殊性，可通過色譜的方法進(jìn)行純化。常用的色譜方法主要有離子交換色譜（IEX）、凝膠過濾（GF）、疏水相互作用（HIC）、反相色譜（RPC）和親和色譜（AC）等[31]。色譜法的選擇取決于多酚氧化酶的類型、電荷、分子量和雜質(zhì)等。為了獲得高純度的目的蛋白，通常會將兩種或兩種以上的色譜法相結(jié)合進(jìn)行操作[32-33]。如表3所示，通過離子交換色譜和凝膠過濾色譜，山藥、花椰菜、人參果中PPO的純化倍數(shù)分別提高了76.2，66和51倍[23-24,34]，富士蘋果PPO僅用了一種色譜法，其純化倍數(shù)也提高了64.3倍[25]，說明利用色譜法可以有效純化多酚氧化酶。為了保證酶活性，大部分試驗(yàn)選擇pH在6～8范圍內(nèi)的洗脫液，通過逐步的線性梯度洗脫以減少蛋白酶的損失。在進(jìn)行色譜法之前，采用溫度誘導(dǎo)分離法和雙水相等提取方法，可以進(jìn)一步增加酶的回收率[15,25,35]。色譜法可以有效實(shí)現(xiàn)高純度PPO的純化，為了提高其活性回收率，可以通過數(shù)學(xué)建模的方式優(yōu)化色譜分離條件。

3 PPO的理化性質(zhì)

由于多酚氧化酶重要的生理意義，其性質(zhì)受到研究者的關(guān)注，分子量、溫度、pH、底物特異性和抑制劑作用等特征被廣泛研究。

3.1 分子量與結(jié)構(gòu)

植物PPO主要由轉(zhuǎn)運(yùn)肽、Cu原子結(jié)合區(qū)域和疏水區(qū)域三部分組成[36-37]。轉(zhuǎn)運(yùn)肽是葉綠體蛋白的典型特征，主要作用是指導(dǎo)PPO進(jìn)入類囊體膜，分子量約為4～9 kDa；Cu原子結(jié)合區(qū)是PPO的主要功能區(qū)域，具有高度保守性且分子量約為40 kDa，大多數(shù)植物、動物、細(xì)菌和真菌PPO具有兩個Cu原子結(jié)合區(qū)（CuA和CuB），其中CuA的保守性大于CuB；Cu原子結(jié)合區(qū)對PPO的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象起到維持作用，主要是由一個耦合的雙核3型銅中心組成，漆酶則含有4個銅離子組成的三核中心[38]。C-末端是疏水性的，其結(jié)構(gòu)區(qū)域屏蔽了PPO的活性位點(diǎn)，因此在正常生理?xiàng)l件下，酶活性非常低[6]。由于PPO來源廣泛以及基因的復(fù)雜性，其分離純化和結(jié)晶的難度較大，因此高級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息仍未被發(fā)現(xiàn)。目前，從歌海娜葡萄（Vitis vinifera）中分離出的多酚氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到發(fā)現(xiàn)，X-射線分析發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶是以α-螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)，與組氨酸結(jié)合的銅離子活性位點(diǎn)位于螺旋束的中心位置[39]。

由于多酚氧化酶的不同存在形式及同工酶的存在，不同植物、同一植物不同部位及同一部位的PPO分子量存在差異。多酚氧化酶的活性不受SDS的干擾，分子量的測定通常采用SDS-PAGE電泳法與已知分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較[40]。如表3所示，不同來源PPO的分子量大致在45～130 kDa之間，在某些情況下可以觀察到PPO存在多個條帶，說明同一來源的PPO中存在不同的亞型[41-42]。

3.2 最適溫度和pH

酸堿介質(zhì)會影響酶活性位點(diǎn)基團(tuán)的電離，從而改變活性位點(diǎn)的正確構(gòu)象或阻礙酶-底物結(jié)合的催化反應(yīng)[43]。植物PPO的最佳pH因植物來源的不同而存在差異，但是一般在4.5～7.5之間（表4）。一些PPO顯示了兩個最佳pH，這是由于提取物中存在不同的PPO亞型[44-45]。溫度是催化PPO活性的另一個重要因素，低溫條件會降低反應(yīng)分子的活動速率，高溫下酶分子的結(jié)構(gòu)完整性受到破壞和變性。溫度的改變也會影響氧氣的溶解度，進(jìn)而影響酶促褐變。PPO的最適溫度在8～70 ℃之間，其變化取決于植物來源和底物類型[46-50]。

表3 采用不同色譜方法純化不同來源的PPO

3.3 底物特異性和抑制劑

酚類物質(zhì)是PPO的關(guān)鍵底物，酶活性與酚類物質(zhì)的種類有關(guān)[51]。鄰苯二酚是目前應(yīng)用最廣泛的底物，研究表明，PPO的底物特異性與植物品種有關(guān)（表5）[52-54]。抑制劑作為控制酶促褐變的有效手段被廣泛研究，根據(jù)其作用機(jī)理，可分為六類：（1）還原劑（抗壞血酸及其類似物、亞硫酸鹽等）；（2）螯合劑（乙二胺四乙酸乙酯、疊氮鈉等）；（3）絡(luò)合劑（環(huán)糊精、殼聚糖等）；（4）酸類物質(zhì)（抗壞血酸、檸檬酸等）；（5）酶抑制劑（底物類似物、鹵化物等）；（6）酶處理劑（蛋白酶、鄰甲基轉(zhuǎn)移酶等）[55]。這些化合物通過消除反應(yīng)過程中的參與元素如酶、底物、銅原子或反應(yīng)中間產(chǎn)物來降低或抑制褐變的反應(yīng)速率。不同來源的PPO與抑制劑的反應(yīng)相似，但是其抑制效果可能會有顯著差異。

表5 不同來源PPO的底物特異性和最佳抑制劑

4 結(jié)語與展望

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，鹽沉淀法、色譜法、溫度誘導(dǎo)法、三相分離法和雙水相法是多酚氧化酶最常用的分離純化方法，為了提高酶活性和提取效率，親和層析、超濾或金屬結(jié)合等方法可用于后續(xù)試驗(yàn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)眾多水果中的多酚氧化酶主要以結(jié)合態(tài)的形式存在，如蘋果中可溶態(tài)只占了8%～15%[42]。膜結(jié)合態(tài)的多酚氧化酶與葉綠體內(nèi)囊體膜結(jié)合，處于低活性狀態(tài)，在外界環(huán)境的刺激下，膜系統(tǒng)受到破壞或膜的通透性發(fā)生改變，結(jié)合態(tài)的多酚氧化酶會逐漸轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)，使多酚氧化酶的酶活提高。植物中結(jié)合態(tài)多酚氧化酶負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)初始酶量的積累，說明了結(jié)合態(tài)多酚氧化酶研究的重要性，但是國內(nèi)外對可溶態(tài)多酚氧化酶的分離和性質(zhì)研究較多，對結(jié)合態(tài)多酚氧化酶未展開系統(tǒng)性的研究，其作用機(jī)理未被完全闡明，一些核心問題仍未被解決[56-57]?，F(xiàn)今分子生物學(xué)已被廣泛應(yīng)用于酶的功能，但是關(guān)于該酶的潛伏期現(xiàn)象以及其在體內(nèi)是如何轉(zhuǎn)化為活性形式和控制潛伏態(tài)向活性態(tài)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)理尚不清楚[58]。關(guān)于多酚氧化酶與底物的相互作用以及在不同環(huán)境中它們是如何相互影響還需要進(jìn)一步研究[59]。多酚氧化酶在應(yīng)對病原體和食草動物的侵襲以及防御和應(yīng)激反應(yīng)之間的相關(guān)性已經(jīng)被證實(shí)，但是多酚氧化酶是如何增強(qiáng)植物抗病性的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究[60]。目前關(guān)于多酚氧化酶在除葉綠體外的其他細(xì)胞器中的定位，在植物和真菌細(xì)胞中不同發(fā)育階段的功能和活性水平仍是研究的重點(diǎn)[61]。多酚氧化酶在食品加工和褐變反應(yīng)中有著重要作用，未來的研究仍應(yīng)更多地關(guān)注酶的作用機(jī)制，以期深入推進(jìn)多酚氧化酶對植物體生理變化規(guī)律的研究。