核桃肽制備工藝的研究進(jìn)展

郝云濤，珠娜，李勇*

北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系（北京 100191）

中國(guó)核桃資源豐富，產(chǎn)量居世界第一位，但主要應(yīng)用于榨油及初級(jí)食品制作，產(chǎn)品附加值低，如何充分發(fā)揮核桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，是食品科技工作者和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，隨著肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)的建立與發(fā)展，以及相關(guān)制備技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)核桃的開發(fā)重點(diǎn)也由提取油脂轉(zhuǎn)移到制備肽類物質(zhì)，且開發(fā)制備的核桃肽類物質(zhì)在抗氧化性、抗疲勞、調(diào)節(jié)血壓、提高學(xué)習(xí)記憶等方面表現(xiàn)出顯著功效[1-4]。從最初核桃制油到后來核桃蛋白的制備，至如今核桃肽的制備，所用制備方法和關(guān)鍵技術(shù)不同，可在充分掌握目標(biāo)物質(zhì)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，選擇合適的制備方法和技術(shù)，將其活性肽類成分進(jìn)一步富集，制取足量的食源性藥物，推動(dòng)全人類健康事業(yè)發(fā)展。

1 核桃肽的定義及組成

核桃蛋白質(zhì)含量豐富，約占16.66%，且氨基酸種類齊全，包含人體必需的8種必需氨基酸，此外，其氨基酸模式與人體蛋白質(zhì)氨基酸模式近似，為制備核桃肽提供良好物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。核桃肽是由核桃蛋白經(jīng)水解而獲得的具有生物活性功能的一類物質(zhì)，根據(jù)分子量和所含氨基酸數(shù)目分為核桃多肽與核桃寡肽。核桃肽的分子量、氨基酸數(shù)目及排列并非固定，受核桃產(chǎn)地、品種及制備方法和技術(shù)的影響。邵靜哲[7]通過黑曲霉3.350發(fā)酵核桃粕制取的核桃肽，分子量＜10 kDa的肽占70.47%，分子量＜5 kDa的肽占47.24%。陳樹俊等[8]以高蛋白核桃粉為原料，選用復(fù)合蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解制備核桃肽，分析發(fā)現(xiàn)分子量≤5 kDa的肽占64.94%，其他分子量分布依次為5～10 kDa（23.33%）≥30 kDa（6.41%）和10～30 kDa（5.32%）。

2 核桃肽的理化性質(zhì)

與核桃蛋白相比，其水解產(chǎn)物核桃肽具有高濃度、低黏度、溶解性好、還原能力強(qiáng)及對(duì)pH變化相對(duì)穩(wěn)定等良好特性，在起泡性、乳化性及吸油性等方面優(yōu)于核桃蛋白[9-11]。核桃肽優(yōu)良的理化特性進(jìn)一步提升其加工特性，為核桃肽更廣泛的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，開發(fā)豐富的核桃肽產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)。

3 核桃肽的制備

核桃油脂含量高，一般將榨油后的核桃粕作為制備核桃肽的原料，這也是對(duì)核桃綜合利用思想的體現(xiàn)。核桃肽的制備思路是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行不同程度分解，將其肽段釋放，經(jīng)過分離、純化、富集等步驟，制備得到核桃肽。核桃肽的制備工藝流程為：

核桃→預(yù)處理→提取核桃蛋白→水解→核桃蛋白水解產(chǎn)物→分離純化→核桃肽類物質(zhì)

3.1 核桃原料預(yù)處理

核桃種皮為包裹在核桃仁表面的一層薄膜，呈黃色或淺黃色，在貯存過程中會(huì)出現(xiàn)氧化、褐變現(xiàn)象。此外，核桃種皮含有大量酚類物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生令人不悅的收斂性口感，會(huì)使核桃蛋白凝集沉淀，還會(huì)影響核桃產(chǎn)品色澤，降低感官品質(zhì)，因此需通過熱水浸泡、堿液浸泡等方法將種皮去除，再進(jìn)行下一步處理[12-13]。預(yù)處理的另一步驟是將去皮后的核桃仁榨油，對(duì)常用的核桃油提取方法優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用范圍進(jìn)行比較，如表1所示[14-17]。

表1 常見油脂提取方法比較

近年來，很多學(xué)者在核桃油脂提取過程采用特定輔助提取技術(shù)，提高提取效率，提升油脂品質(zhì)。作為一種新型提取分離技術(shù)，超臨界流體萃取技術(shù)解決溶劑提取法在分離過程中需蒸餾加熱、溶劑殘留、油脂易氧化酸敗等不足，解決壓榨法工藝繁瑣、產(chǎn)率低、油品色澤不佳等缺點(diǎn)，在油脂加工及其綜合利用方面有廣泛的研究和應(yīng)用[18]。

3.2 核桃蛋白質(zhì)的提取

核桃蛋白提取方法眾多，大部分核桃蛋白質(zhì)可溶于水、鹽溶液、稀酸和/或稀堿溶液，少部分與脂類等物質(zhì)相結(jié)合的核桃蛋白質(zhì)，可溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑；不同提取溶劑影響蛋白質(zhì)的提取效率和純度，但對(duì)核桃蛋白的結(jié)構(gòu)影響不顯著，較常用的方法為堿溶酸沉法[19-20]。隨著科技進(jìn)步，有研究采用超聲波、微波等輔助技術(shù)對(duì)核桃蛋白的提取過程進(jìn)行優(yōu)化，增大提取效率的同時(shí)，縮短提取時(shí)間[21]。李婷等[22]通過超聲輔助提取核桃蛋白，提取率超過70%，且所得核桃蛋白具有良好的生物活性，為其深加工制備核桃肽奠定基礎(chǔ)。

3.3 核桃蛋白質(zhì)的水解

3.3.1 核桃蛋白質(zhì)的預(yù)處理技術(shù)

核桃蛋白含有緊密立體結(jié)構(gòu)，酶切位點(diǎn)包藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此很難被蛋白酶充分水解，常規(guī)酶法水解蛋白質(zhì)的水解度相對(duì)較低，且費(fèi)時(shí)、條件苛刻[23]。為進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的水解效率和效果，可對(duì)核桃蛋白進(jìn)行預(yù)處理，使其變性、酶切位點(diǎn)暴露，從而易與酶直接結(jié)合，有效提高水解效率。常見的預(yù)處理方法包括微波、超聲波、熱處理、凍融和超高壓等技術(shù)。呂瑩等[24]通過比較不同預(yù)處理方式對(duì)酶解脫脂核桃粕所得核桃肽抗氧化活性和得率的影響，發(fā)現(xiàn)加熱、超聲波、微波和堿提等預(yù)處理可提高脫脂核桃粕酶解效率，所得核桃肽的抗氧化活性和得率均高于未經(jīng)預(yù)處理的產(chǎn)品。

3.3.2 核桃蛋白質(zhì)的水解方法

生物活性肽制備通常采用直接分離提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、蛋白質(zhì)酶解法等。對(duì)于核桃肽制備應(yīng)用較多的是蛋白酶解法及微生物發(fā)酵法，通過調(diào)整水解條件，獲得不同水解度的水解產(chǎn)物，進(jìn)而分離純化得到核桃肽類物質(zhì)。

3.3.2.1 蛋白酶解法

蛋白酶解法制備生物活性肽是采用蛋白酶水解蛋白質(zhì)得到酶解液，再對(duì)其進(jìn)行分離純化得到生物活性肽的過程。此法操作簡(jiǎn)便、高效，且酶解過程容易控制，但需對(duì)所得酶解液進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化。常用的蛋白酶包括動(dòng)物蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）、植物蛋白酶（菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等）及微生物來源的酶（中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶等）。不同酶的最適酶解條件及酶切位點(diǎn)不同，因此，最終蛋白水解產(chǎn)物的組成和結(jié)構(gòu)不同，在實(shí)際應(yīng)用過程中需要根據(jù)蛋白質(zhì)原料特性和生產(chǎn)制備目的對(duì)蛋白酶進(jìn)行選擇。常見的蛋白酶及其作用位點(diǎn)見表2[25]。

表2 常見蛋白酶的作用位點(diǎn)

蛋白酶解法制備核桃肽的關(guān)鍵是酶的選擇，許磊[26]以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步確定水解核桃蛋白的幾種酶的酶解效果為：堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞胃蛋白酶?？惮|麗等[27]采用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶3種酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解能力差別較大，由大到小依次為Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。

此外，優(yōu)化酶解條件對(duì)提取性質(zhì)優(yōu)良的核桃肽的重要性不容忽視。酶解條件如酶解溫度、時(shí)間、最適pH、酶添加量等會(huì)影響生成肽鏈的長(zhǎng)度、氨基酸順序及游離氨基酸數(shù)量，最終影響產(chǎn)物生物活性。王紀(jì)輝等[28]采用中性蛋白酶水解核桃餅粕蛋白，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，發(fā)現(xiàn)其最佳酶解條件為：酶解時(shí)間3 h、酶解溫度38 ℃、pH 6.8、酶添加量4%、底物濃度2.4%，此時(shí)核桃多肽抗氧化活性最高，DPPH·清除率達(dá)92.35%。姜莉等[29]對(duì)木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，證明各因素對(duì)酶解物ACE抑制率的影響順序?yàn)椋簆H＞溫度＞底物濃度＞E/S（酶與底物濃度之比），并得到最佳酶解條件：pH 7.5、溫度50 ℃、底物濃度30 g/kg、E/S 6 000 U/kg、酶解時(shí)間4 h。

為進(jìn)一步提高酶解法制備核桃肽的效率及產(chǎn)品質(zhì)量，提升酶解效率的方法有：1）固定化酶的使用，為提高生物酶制劑使用效率，科研工作者將酶進(jìn)行固定化，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。薛洋等[30]利用海藻酸鈣包埋中性蛋白酶Neutrase 0.8 L，在最適酶解條件下，將3.5 g/L固定化酶加入核桃蛋白溶液中，保溫5 h后核桃蛋白水解度可達(dá)18.37%，且酶解物具有較強(qiáng)的還原能力，固定化酶活力回收率為57%。2）采用復(fù)合酶水解，多酶水解法制得肽的活性普遍優(yōu)于單酶水解法，但由于不同種類的酶達(dá)到最高酶活力所需的溫度、pH和酶解時(shí)間等條件不同，多酶復(fù)合水解比單酶水解稍復(fù)雜，如果不同種酶的適宜溫度或pH差異較大，在一種酶水解后，須先滅酶處理再加入另一種酶[31]。李榕[32]的試驗(yàn)研究顯示，先在溫度55 ℃，pH 8.0，胰蛋白酶添加量2 000 U/g條件下水解 4.0 h，在溫度50 ℃、pH 7.0、中性蛋白酶添加量3 100 U/g條件下水解 2.7 h，水解度為36.35%，氮回收率為92.53%；相比中性蛋白酶、胰蛋白酶單獨(dú)水解核桃蛋白，水解度分別提高20.11%和17.79%，氮回收率分別提高29.20%和27.29%。3）酶解過程中采用強(qiáng)化技術(shù)，常用的強(qiáng)化酶解技術(shù)為超聲、微波輔助技術(shù)。張興燦[33]通過監(jiān)測(cè)蛋白水解度，對(duì)蛋白酶在微波加熱和水浴加熱2種條件下水解核桃蛋白的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波加熱只需不到10 min即可達(dá)到所需效果，而水浴加熱則需2 h。何秋實(shí)[34]利用超聲輔助復(fù)合酶水解制備核桃抗氧化肽，最佳工藝條件下制備的核桃多肽DPPH自由基清除率顯著提高，達(dá)84.94%，抗氧化能力與維生素E接近。

3.3.2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法制備活性肽是通過有益菌株自身產(chǎn)生的胞外酶系，有序降解大分子蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種肽類。相比蛋白酶解法，此法不需額外添加其它蛋白酶，減少蛋白酶制備和純化的過程。發(fā)酵法制備肽的研究主要集中在發(fā)酵菌種和原料篩選，以及發(fā)酵工藝革新與肽類活性開發(fā)，菌種多選擇蛋白酶活力較強(qiáng)的細(xì)菌、霉菌及可除去腥味的酵母菌[35]。謝翠品等[36]利用黑曲霉對(duì)核桃粕進(jìn)行發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多種高效蛋白酶，水解核桃蛋白得到核桃多肽，具有蛋白酶源豐富、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種活性肽。高瑞雄等[37]采用納豆芽孢桿菌對(duì)冷榨核桃粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽，其最優(yōu)工藝條件為：底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、接種量11%、起始pH 8.0、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間84 h，該條件下蛋白水解度與核桃多肽質(zhì)量濃度均達(dá)到最大值，分別為37.5%和2.58 mg/mL。

但微生物代謝產(chǎn)生的酶系較復(fù)雜，水解副產(chǎn)物較多，而且受到菌種使用安全的限制，微生物發(fā)酵法難以展開推廣。此外，化學(xué)水解（酸或堿）生產(chǎn)生物活性肽的過程中，會(huì)損壞L-型氨基酸，產(chǎn)生D-型氨基酸，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致不良物質(zhì)（如賴-丙氨酸）形成，因此大幅降低所得水解物營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。而通過基因工程生產(chǎn)活性肽，不僅人力和物力投入較大，其安全性有待進(jìn)一步探討[38]。因此蛋白酶解法仍是制備包括核桃肽在內(nèi)的各種活性肽的主要方法。

3.4 核桃肽分離純化技術(shù)

國(guó)內(nèi)外研究證明酶法制得低分子量核桃肽的許多生理功能在一定程度上強(qiáng)于分子量較高的核桃肽[39-40]。因此，通過控制酶解條件及后續(xù)分離純化技術(shù)制備核桃寡肽，可進(jìn)一步促進(jìn)肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)發(fā)展。

但高活性核桃肽肽段氨基酸數(shù)目一般小于20，分子量小且比較接近，因此分離純化難度較大。近年來，科研人員發(fā)現(xiàn)一系列新型分離技術(shù)，如柱層析法、高效液相色譜法、超濾膜分離法等[41-43]。柱層析法分離純化核桃肽應(yīng)用廣泛，常用的層析柱包括離子交換柱、凝膠柱、大孔樹脂層析柱等，使用不同的層析柱或聯(lián)用多種層析柱，可分離不同分子量的組分。Gu等[44]通過Sephadex G-15結(jié)合C18反相柱進(jìn)行核桃肽的分離純化，篩選高抗氧化性的核桃肽并進(jìn)行氨基酸測(cè)序，為進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。Chen等[45]采用SP-825大孔樹脂對(duì)核桃肽進(jìn)行分離，通過蒸餾水和梯度乙醇進(jìn)行洗脫，分離出3個(gè)組分的肽段，再經(jīng)過中壓液相系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化得到具有改善學(xué)習(xí)記憶功能的核桃肽。李漢洋等[46]使用DA 201-C大孔樹脂和Sephadex G-15葡聚糖凝膠對(duì)核桃粕蛋白酶解液進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DA201-C大孔樹脂分離的多肽組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（疏水性氨基酸含量依次增大）的抗氧化活性依次增大，組分Ⅲ經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠分離純化得到a、b、c、d 4種分子量不同的多肽組分（分子量a＞b＞c＞d）；其中組分c（分子量400～700 Da）的·OH清除能力最強(qiáng)，并含有較多的谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，與組分Ⅲ氨基酸組成相似。

除通過分子量的差異來分離純化核桃肽之外，還可根據(jù)肽段的性質(zhì)不同對(duì)核桃肽進(jìn)行分離。呂瑩等[47]通過鐵離子螯合親和層析法對(duì)核桃肽進(jìn)行吸附，采用Na2HPO4進(jìn)行梯度洗脫，得到3個(gè)抗氧化活性不同的組分，并發(fā)現(xiàn)核桃肽的鐵結(jié)合能力越強(qiáng)，其抗氧化活性越高。

3.5 核桃肽的精制

酶解法制備活性肽最為普遍，但其制備過程中存在離子引入，并且發(fā)酵過程中難免發(fā)生美拉德反應(yīng)而使肽帶有顏色，水解過程中產(chǎn)生的疏水性肽還會(huì)使肽帶有不良風(fēng)味（苦味、臭味），限制肽的實(shí)際應(yīng)用。因此，生產(chǎn)合格的核桃肽產(chǎn)品，必須進(jìn)行精制處理，包括脫鹽、脫色、脫苦、穩(wěn)態(tài)化處理等操作。裴曉惠等[48]使用活性炭和β-環(huán)狀糊精對(duì)核桃肽進(jìn)行脫苦，并比較脫苦效果及脫苦后其ACE抑制率所受影響，發(fā)現(xiàn)核桃肽經(jīng)40%的活性炭處理后ACE抑制活性差別較大，降低15.81%，而經(jīng)22%的β-環(huán)狀糊精脫苦處理后ACE抑制活性受影響較小，僅降低0.12%。成靜等[49]以冷榨核桃粕為原料，復(fù)合酶解法制得核桃肽，采用β-環(huán)糊精作為包埋壁材對(duì)核桃肽進(jìn)行微囊化工藝處理，得出微囊化核桃肽的最佳制備工藝：壁材與芯材比例10∶1，包埋溫度60 ℃，包埋時(shí)間1 h。此時(shí)包埋率可達(dá)80.05%，90 d穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明微囊化核桃肽水分增加速率明顯變緩，提示其性質(zhì)更加穩(wěn)定、更易于存儲(chǔ)。

3.6 核桃肽的結(jié)構(gòu)鑒定和氨基酸測(cè)序

生物肽類一般由蛋白質(zhì)經(jīng)生物或化學(xué)方法降解制得，其活性取決于肽的結(jié)構(gòu)，包括氨基酸含量、種類及連接順序；對(duì)活性肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及氨基酸測(cè)序，有助于明確其構(gòu)效關(guān)系，大大推動(dòng)肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)發(fā)展。Zheng等[50]采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜，從脫脂核桃蛋白酶解物中分離純化出ACE抑制肽，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定出2種具有ACE抑制活性的核桃寡肽序列，分別為Val-Gln-Thr-Leu和Leu-Gly-Tyr-Glu-Asn。Lü等[51]將制備純化得到的鐵螯合核桃肽經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS確定其分子量，通過nanoLC-MS/MS分析，最終確定其中2種主要肽段的氨基酸序列：Leu-Ala-Gly-Asn-Pro-Asp-Asp-Glu-Phe-Arg-Pro-Gln和Val-Glu-Asp-Glu-Leu-Val-Aal-Val-Val。

4 結(jié)語(yǔ)

核桃肽是一種混合物，不同制備方法所得核桃肽的結(jié)構(gòu)和組成不同，因此所發(fā)揮的生理功能也不同[52-54]。雖有多種核桃肽制備方法，但微生物水解法副產(chǎn)物較多，且受到菌種使用安全的限制；化學(xué)水解法會(huì)損壞L-型氨基酸，并導(dǎo)致有害物質(zhì)的形成，降低所得水解物的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量；基因工程耗費(fèi)人力、物力較大，其安全性也存在疑問。因此蛋白酶解法仍是制備包括核桃肽在內(nèi)的各種活性肽的主要方法。

對(duì)核桃肽制備工藝進(jìn)一步革新，如探索更高效的蛋白水解酶、優(yōu)化水解條件、精簡(jiǎn)制備流程及研發(fā)新型生產(chǎn)設(shè)備，可進(jìn)一步提高核桃肽生產(chǎn)效率。此外，通過多種技術(shù)有機(jī)結(jié)合，揭示特征肽段的構(gòu)效關(guān)系，并進(jìn)行人工合成技術(shù)研發(fā)，有助于制備出更多具有高功能活性的核桃肽肽段，甚至闡明特定氨基酸序列肽段對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能，指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)開發(fā)出適合特定人群及使用方式的核桃肽類保健產(chǎn)品，更加高效地應(yīng)用于多種疾病防治，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。