枸杞提取液主要成分含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性

周旋，梁曉婕，王亞軍，安巍，李越鯤*

寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所（銀川 750002）

枸杞（Lycium chinense）為茄科多年生落葉灌木，其果實又稱枸杞子，是中國傳統(tǒng)藥食同源中藥材。枸杞子味甘、性平，歸肝、腎經(jīng)，具滋補肝腎、益精明目、延緩衰老等功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)它有降低血糖含量、防止動脈硬化、抗癌、增強機體免疫力、防止老年癡呆癥等作用[2-3]。這些藥用功效多與枸杞的抗氧化成分有關(guān)。

前人對枸杞抗氧化活性的研究主要集中在枸杞提取液及枸杞多糖、黃酮等類成分，對于主要活性成分之間的協(xié)同作用研究較少。試驗以親緣關(guān)系相近、立地條件和田間管理方式相同的“寧杞1號”“大麻葉”“小麻葉”3個枸杞主流栽培品種為材料，研究提取液濃度及枸杞多糖、黃酮、甜菜堿3種主要功效成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性，旨在分析主要活性成分與體外抗氧化活性是否存在相關(guān)性以及哪種化學(xué)成分起主要作用，為進一步揭示枸杞抗氧化機理、研發(fā)枸杞功能性食品提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 枸杞材料

供試的“寧杞1號”“大麻葉”“小麻葉”3個枸杞栽培品種，親緣關(guān)系相近，樹齡相同、栽培及田間管理方式一致，均來自寧夏農(nóng)林科學(xué)院國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃（38°38′49″ N，106°09′10″ E），分別采集3個枸杞品種的前3批果實作為供試樣品，樣品編號見表1。

表1 樣品編號

1.1.2 供試動物

昆明種小鼠，清潔級；性別，雄性；體質(zhì)量，25±2 g；來源，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0004，動物合格證號11401300007838。

1.2 試驗方法

1.2.1 待測液Ⅰ制備及黃酮含量的測定

將枸杞子干燥品粉碎，分別精密稱取約10 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 80%乙醇溶液，超聲處理2次，每次30 min，過濾，濾液置于100 mL量瓶中，殘渣用80%乙醇溶液洗滌3次，合并濾液，加80%乙醇溶液至刻度，搖勻，得待測液Ⅰ，用于測定黃酮含量。

黃酮含量的測定采用紫外可見分光光度法，參考孔令明等[4]的方法并改進。

1.2.2 待測液Ⅱ制備及枸杞多糖含量的測定

上述殘渣連同濾紙置具塞錐形瓶中，加25 mL蒸餾水，在80 ℃水浴中超聲處理2次，每次40 min，趁熱濾過，濾液置100 mL量瓶中，殘渣用熱蒸餾水?dāng)?shù)次洗滌，將洗液倒入濾液中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得待測液Ⅱ。用于測定多糖含量。

多糖含量的測定采用紫外可見分光光度法，參考GB/T 18672—2014。

1.2.3 待測液Ⅲ制備及甜菜堿含量的測定

取待測液Ⅰ與待測液Ⅱ，各50 mL，合并，搖勻，得待測液Ⅲ。用于測定甜菜堿含量及體外抗氧化活性。

甜菜堿含量測定采用高效液相色譜法，參考楊宗學(xué)等[5]方法進行測定。

1.2.4 體外抗氧化活性不同濃度供試液的制備

分別取50 mL待測液Ⅲ，置水浴上濃縮至無醇味，約10 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，作為小鼠體外實驗原液。將原液用生理鹽水按1∶2依次稀釋成50%，25%，12.5%和6.25%的混懸液，作為不同濃度供試液。

1.2.5 對小鼠血清羥自由基清除能力的影響

取50只小鼠，眼眶取血，分離血清，取0.1 mL血清，分別用原液、不同濃度供試液、生理鹽水稀釋20倍，于37 ℃溫浴1 h，吸取0.2 mL，按照羥自由基測定試劑盒說明書方法，在550 nm波長處讀取各孔吸光度（A）[6-7]。每個樣品重復(fù)3次。抑制羥自由基能力按式（1）計算。

抑制羥自由基能力（U/mL）=標準品濃度×（A對照-A測定）×取樣量/[（A標準-A空白）×稀釋倍數(shù)] （1）

1.2.6 對小鼠紅細胞的保護作用

取10只小鼠，小鼠眼眶取血，置肝素抗凝管中，用生理鹽水以2 000 r/min離心15 min，洗滌3次，去除血漿后，用生理鹽水配制0.5%的紅細胞懸液，于4 ℃保存，備用。

取1 mL紅細胞懸液，分別加入原液、不同濃度供試溶液、生理鹽水，各0.1 mL，混勻，再加入0.1 mL 0.1 moL/L H2O2，于37 ℃溫浴1 h，用4 mL生理鹽水稀釋，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，在415 nm波長處讀取吸光度（A1）。對照管以0.1 mL生理鹽水替代樣品液，其余操作同樣品管，測得對照管吸光度（A0）[8]，按式（2）計算溶血抑制率。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.7 對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

取6只小鼠，脫臼處死，剖取肝臟，用0～4 ℃生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干后稱其質(zhì)量，按1∶9（g/mL）用冰生理鹽水在冰水浴中將肝組織制成勻漿液，以3 500 r/min離心15 min，取上清液即為10%肝勻漿液。采用雙縮脲法測定蛋白量（mg prot/mL）。

取0.2 mL 10%肝勻漿液，分別加入原液、不同濃度供試液、生理鹽水各0.1 mL于試管中，混勻，作為測定管，同時以生理鹽水替代樣品溶液作為空白樣品，于37 ℃溫浴1 h，冷卻，吸取0.1 mL，按照過氧化產(chǎn)物MDA測定試劑盒說明書方法測定[6,9]，在532 nm波長處讀取吸光度（A）。每個樣品重復(fù)測定3次。肝MDA含量按式（3）計算。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2013和SPSS 23.0軟件對試驗原始數(shù)據(jù)進行處理與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞子提取液對小鼠血清羥自由基清除能力的影響

由圖1可知，枸杞子提取液濃度在6.25%～25%之間，其對小鼠血清羥自由基清除能力呈上升的趨勢；枸杞子提取液濃度達到25%以后，其對小鼠血清羥自由基清除能力又呈迅速下降的趨勢，整體呈拋物線型變化。提取液濃度在12.5%～50%之間，其具有較好的清除羥自由基能力，且不同品種枸杞提取液變化趨勢一致。

圖1 枸杞子提取液對小鼠血清羥自由基清除能力的影響

2.2 枸杞子提取液對H2O2致小鼠紅細胞溶血抑制率的影響

由圖2可知，隨著枸杞子提取液濃度的增大，小鼠紅細胞溶血抑制率呈上升趨勢，即枸杞子提取液對小鼠紅細胞溶血抑制率的影響隨著其濃度的增大而增強，呈明顯的量效關(guān)系。說明不同品種枸杞子提取液對小鼠紅細胞均有明顯的保護作用。

圖2 枸杞子提取液對小鼠紅細胞保護作用

2.3 枸杞子提取液對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

由圖3可知，隨著枸杞子提取液濃度的增大，其對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化MDA的影響呈先下降后上升的趨勢。除樣品4在濃度25%對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化MDA的影響達到最低值外，其他樣品提取液濃度在12.5%～50%之間差異不顯著。枸杞子提取液濃度在50%～100%之間，小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用被抑制性明顯增強，說明提取液原液抑制肝組織生成MDA的能力較好。

圖3 枸杞子提取液對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

2.4 提取液主要活性成分含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性

為探究枸杞提取液主要活性成分含量與體外抗氧化活性指標之間的關(guān)系，采用雙變量相關(guān)分析的方法，分析兩者之間的相關(guān)性，詳見表2。

表2表明，枸杞多糖與抑制羥自由基能力具有顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.771，p＜0.05），與抑制小鼠肝組織MDA生成能力具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（R=0.812，p＜0.01）；即隨著枸杞提取液中多糖含量的增加，其抑制羥自由基能力不斷增強，抑制MDA生成的能力也不斷增大；通過一元線性回歸分析得到多糖含量與抑制羥自由基能力的線性方程：y=2.912x+200.3，R2=0.594（圖4）；抑制小鼠肝組織MDA生成能力的線性方程為：y=0.014x+0.428，R2=0.660（圖5）。而枸杞提取液中枸杞多糖與溶血抑制率之間不具有顯著相關(guān)性（p＞0.05），兩者之間存在負相關(guān)關(guān)系（表1）。

同時，從表2中還可以看出枸杞提取液中黃酮、甜菜堿與3個體外抗氧化活性指標互相之間均不具有顯著相關(guān)性（p＞0.05）；其中：黃酮與抑制羥自由基能力和抑制MDA生成能力存在負相關(guān)關(guān)系，與溶血抑制率存在正相關(guān)關(guān)系；甜菜堿與3個體外抗氧化活性指標均具有負相關(guān)關(guān)系。

另外，從表2還可以看出，體外抗氧化活性與3種成分之一呈正相關(guān)關(guān)系，而與另外2種呈負相關(guān)關(guān)系，也就是說體外抗氧化活性由其中一種成分決定，3種成分之間是否存在拮抗作用及其作用機制，有待進一步研究。

表2 枸杞提取液主要活性成分含量與體外抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)

圖4 枸杞多糖含量與清除小鼠血清羥自由基能力的相關(guān)性

圖5 枸杞多糖含量與抑制小鼠肝組織MDA生成的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

近年來，諸多研究結(jié)果表明人工合成抗氧化劑副作用多，影響人體健康，對人體肝、脾、肺均會產(chǎn)生有不利作用，甚至?xí)T發(fā)惡性腫瘤等。天然抗氧化劑成分毒性遠低于人工合成的抗氧化劑。因此，天然抗氧化劑的研究受到研究者的青睞，尤其是中草藥提取物的抗氧化作用受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[10-13]。

研究表明，貫穿枸杞延緩衰老、抗脂肪肝、增強肌體免疫力等多種功能的是枸杞的抗氧化功能，因為由活性氧導(dǎo)致的氧化脅迫和氧化損傷是造成人體多種器官疾病和機體衰老的一個重要原因[14-15]。

試驗研究了親緣關(guān)系最近，立地條件、管理措施相同的不同枸杞品種、不同批次樣品提取液濃度與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)枸杞提取液有清除羥自由基、保護紅細胞、抑制脂質(zhì)過氧化的作用，枸杞提取液濃度與抗氧化活性存在一定的量效關(guān)系，且不同品種、不同批次枸杞變化趨勢一致。鑒于可以規(guī)避外界因素對試驗結(jié)果的影響。試驗進一步分析了主要活性成分枸杞多糖、黃酮、甜菜堿與抗氧化活性之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，枸杞多糖含量與清除小鼠血清羥自由基能力呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與抑制肝組織生成MDA能力呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，這與前人對枸杞多糖單一成分的研究結(jié)果一致[16]。另外，體外抗氧化活性均與其中一種成分含量呈正相關(guān)關(guān)系，而與另外2種成分含量呈負相關(guān)關(guān)系，3種主要活性成分是否存在拮抗作用及具體的作用機制有待于進一步研究。

此次試驗對于枸杞的有效開發(fā)和利用具有重要的參考價值，對于枸杞天然抗氧化劑及功能食品的開發(fā)具有十分重要的理論價值和實際價值。另外，枸杞多糖、黃酮、甜菜堿與其他活性成分如類胡蘿卜素、VC等多種成分的交互作用有待進一步研究。