海藻酸鈉-乳清蛋白復(fù)合包埋益生菌及特性

周莉，王曉瑞，譚靜，平洋，徐鐘*

河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司（鄭州 450002）

益生菌具有卓越的益生功效[1]，不僅有利于維持腸道菌群平衡[2]，增強(qiáng)胃腸道黏膜屏障[3]，而且能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[4]，預(yù)防癌癥[5]，降低膽固醇[6]，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7-8]。然而，益生菌對(duì)人體的保健效果與其到達(dá)腸道的菌活密切相關(guān)。胃腸道環(huán)境中的多種不良因素，尤其是胃酸，會(huì)使益生菌的活菌數(shù)量顯著下降，明顯限制其益生功能的發(fā)揮[9]。益生菌如果未經(jīng)改造，生命力十分脆弱，是無法耐久存的，利用微膠囊技術(shù)，通過一定手段將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中[10]，不僅能在加工或儲(chǔ)藏過程中提高益生菌的有效活菌數(shù)，還能在通過胃腸道期間對(duì)益生菌進(jìn)行保護(hù)，使其以較少的活性損失到達(dá)腸道靶位點(diǎn)[11]，可有效增強(qiáng)菌體對(duì)消化道逆環(huán)境的抵抗力，并將益生菌在適當(dāng)?shù)奈恢冕尫牛l(fā)揮其益生作用[12-13]。

試驗(yàn)擬制備海藻酸鈉和乳清蛋白雙層復(fù)合包埋益生菌微膠囊。以乳清蛋白包裹菌體形成營養(yǎng)保護(hù)層，與具有良好生物相容性和腸溶性的海藻酸鈉發(fā)生交聯(lián)凝聚發(fā)應(yīng)，形成在胃中不消化、耐酸性能更好的雙層微膠囊。該雙層微膠囊即可發(fā)揮乳清蛋白高營養(yǎng)價(jià)值、網(wǎng)絡(luò)鎖水功能和對(duì)于益生菌的活性保護(hù)作用[14]，又可利用外層凝膠避免其在胃中水解。雙層包埋的益生菌比單層包埋益生菌更能抵御胃液的侵害。將乳清蛋白與海藻酸鈉作為益生菌的包埋壁材，為益生菌的包埋研究提供依據(jù)，可以解決益生菌制劑在生產(chǎn)、使用過程中活性、數(shù)量及效價(jià)損失嚴(yán)重的問題，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂（青島海博）；兩歧雙歧桿菌（廣東環(huán)凱，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存）；胃蛋白酶、胰蛋白酶（Biofroxx）；海藻酸鈉、乳清蛋白（80%）（源葉生物）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈣、氯化鈉、鹽酸（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱、DPX-9162B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（海司樂儀器有限公司）；UNIVERSAL 320R型高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；QL-866型旋渦振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；BSC-1500ⅡB2-X型生物安全柜（鑫貝西Biobase）；SHZ-82型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）；700 Series型-80 ℃冰箱（中科美菱）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milipore）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化培養(yǎng)

將保存的兩歧雙歧桿菌接種于MRS肉湯中，于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，將植物乳桿菌、干酪乳桿菌接種于MRS肉湯中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)18 h，并根據(jù)2%接種量接種，連續(xù)活化傳代2～3次。以6 000 r/min離心5 min，用0.85%無菌生理鹽水洗滌2次，重懸于生理鹽水中，使此濃縮菌液為109CFU/mL。利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)濃縮菌液進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。

1.3.2 益生菌微膠囊的制備[15]

稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉粉末溶于滅菌水中，70℃下水浴加熱過夜至粉末充分溶解，制得海藻酸鈉溶液，并經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾除菌，冷卻備用。稱取一定質(zhì)量的乳清蛋白粉末，溶于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸的無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌直至溶解完全。使用磁力攪拌器在800 r/min下，攪拌懸浮1 h后備用。

稱取一定質(zhì)量的氯化鈣顆粒溶于雙蒸水，以121℃高壓滅菌15 min，制得氯化鈣溶液，將菌液、乳清蛋白和海藻酸鈉以一定的比例混合，用注射器將10 mL混合液滴入100 mL CaCl2固化劑中，形成微囊，磁力攪拌器攪拌30 min，使微囊充分凝固，用蒸餾水沖洗3次，除去多余的鈣離子和未被包埋的益生菌，即得濕膠囊。

1.3.3 微膠囊包埋率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g濕微膠囊樣品，加入9 mL解囊液中[PBS緩沖液（pH 7.4）][16]，振搖10 min至完全解囊。將梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù)。微膠囊的包埋率計(jì)算公式：

包埋率=微膠囊中包埋的活菌數(shù)/制備微膠囊時(shí)添加的活菌數(shù)×100% （1）

1.3.4 益生菌微膠囊制備工藝優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)測(cè)定不同海藻酸鈉濃度（1%，2%，3%，5%和8%）、乳清蛋白濃度（3%，5%，8%，10%和12%）、氯化鈣濃度（1%，2%，3%，5%和8%）和攪拌速度（200，400，600，800和1 000 r/min）對(duì)復(fù)合益生菌微膠囊的影響。采用四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究4個(gè)因素對(duì)微膠囊包埋率的影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4.1 海藻酸鈉最佳濃度的確定

在乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，海藻酸鈉濃度1%，2%，3%，5%和8%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測(cè)定指標(biāo)，探究海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響，以確定海藻酸鈉的最佳濃度。

1.3.4.2 乳清蛋白最佳濃度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，攪拌速度800 r/min，乳清蛋白濃度3%，5%，8%，10%和12%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測(cè)定指標(biāo)，探究乳清蛋白濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響，以確定乳清蛋白的最佳濃度。

1.3.4.3 氯化鈣最佳濃度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度1%，2%，3%，5%和8%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測(cè)定指標(biāo)，探究氯化鈣濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響，以確定氯化鈣的最佳濃度。

1.3.4.4 攪拌速度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%的條件下，參照微膠囊的制備工藝形成微囊后，然后用磁力攪拌器攪拌，攪拌速度為200，400，600，800和1 000 r/min，過濾，并用蒸餾水將膠囊沖洗3次，即得濕膠囊。以微膠囊的包埋率為測(cè)定指標(biāo)。

1.3.5 益生菌微膠囊在模擬胃液中的耐受性

模擬人工胃液[17]：取16.4 mL稀鹽酸，加約800 mL水，調(diào)pH至2.0，加10 g胃蛋白酶，攪勻后加水定容至1 000 mL即可。

取0.5 g微膠囊加入到模擬胃液（4.5 mL）中，充分混勻15 s，在37 ℃條件下，以200 r/min在搖床中振蕩處理30，60，90，120和150 min，分別離心收集取樣，活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.6 益生菌微膠囊在模擬腸液中的釋放性

模擬人工腸液[18]：取6.8 g磷酸二氫鉀，加500 mL水。用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 6.8；另取10 g胰蛋白酶，加適量水使其溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL即可。

取0.5 g微膠囊加入到模擬腸液（4.5 mL）中，充分混勻15 s，在37 ℃條件下，以200 r/min在搖床中振蕩處理30，60，90，120和150 min，分別離心收集取樣，活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.7 益生菌膠囊產(chǎn)品儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將最佳工藝條件下包埋的兩歧雙歧桿菌益生菌微膠囊置于4 ℃條件下進(jìn)行保藏，每隔7 d取樣計(jì)活菌數(shù)，檢測(cè)微膠囊的穩(wěn)定性。相同條件下取未被包埋的兩歧雙歧桿菌置于4 ℃條件下進(jìn)行保藏，每隔7 d取樣計(jì)活菌數(shù)。

2 結(jié)果及討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)益生菌微膠囊的影響

試驗(yàn)中，保持乳清蛋白濃度10%、氯化鈣濃度2%，在海藻酸鈉濃度1%，2%，3%，5%和8%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖1。在一定范圍內(nèi)，包埋率隨海藻酸鈉濃度的加大而增大，海藻酸鈉濃度3%時(shí)，包埋率達(dá)到最大。海藻酸鈉繼續(xù)增大時(shí)，包埋率降低。這是由于海藻酸鈉濃度高時(shí)，溶液黏度增大，益生菌不易分散；海藻酸鈉濃度低時(shí)，形成的凝膠顆粒小，機(jī)械強(qiáng)度低，不能有效包埋菌體，影響包埋效果。因此，以海藻酸鈉濃度3%作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.1.2 乳清蛋白濃度對(duì)益生菌微膠囊的影響

保持海藻酸鈉濃度3%、氯化鈣濃度2%，乳清蛋白濃度3%，5%，8%，10%和12%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖2。乳清蛋白濃度10%時(shí)，微膠囊所包埋的菌落數(shù)最多，包埋的效果最好。乳清蛋白濃度小于10%時(shí)，隨著乳清蛋白濃度的升高，包埋率也增大；海藻酸鈉濃度大于10%時(shí)，包埋率反而降低。可能由于，隨著乳清蛋白濃度的增大，乳清蛋白與海藻酸鈉結(jié)合越來越緊密，對(duì)包埋物質(zhì)擴(kuò)散的抑制作用增強(qiáng)，包埋率增加。乳清蛋白濃度增大到12%，對(duì)減少包埋過程中的損失減少，對(duì)包埋率影響較弱。

2.1.3 氯化鈣濃度對(duì)益生菌微膠囊的影響

試驗(yàn)中，保持海藻酸鈉濃度3%、乳清蛋白濃度10%，在氯化鈣濃度1%，2%，3%，5%和8%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖3。氯化鈣濃度小于2%時(shí)，隨著氯化鈣濃度的升高，包埋率也增大，氯化鈣濃度2%時(shí)，包埋率達(dá)到最大值。

圖2 乳清蛋白濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

圖3 氯化鈣濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.1.4 攪拌速率對(duì)益生菌微膠囊的影響

試驗(yàn)中，在海藻酸鈉濃度3%、乳清蛋白濃度10%、氯化鈣濃度2%，攪拌速度200，400，600，800和1 000 r/min條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖4。攪拌速率的不同，菌體的包埋率也不盡相同，攪拌速率800 r/min時(shí)的包埋率最大，攪拌速率200 r/min時(shí)的包埋率最小。在不改變其他試驗(yàn)工藝條件下，攪拌速度的逐漸增加會(huì)導(dǎo)致微膠囊的包埋率出現(xiàn)先升高后降低的情況。攪拌速度800 r/min時(shí)，包埋率為78%，與其他試驗(yàn)組有明顯差異性。

圖4 攪拌速率對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.2 正交優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)中獲得的最適條件為基礎(chǔ)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察海藻酸鈉、乳清蛋白、氯化鈣濃度和攪拌速度等參數(shù)對(duì)益生菌微膠囊包埋效果的影響，所得結(jié)果如表3所示。

單因素分析規(guī)律是試驗(yàn)因素對(duì)指標(biāo)的影響呈正相關(guān)，極差順序比較依次為：海藻酸鈉濃度（A）＞乳清蛋白濃度（B）＞氯化鈣濃度（C）＞攪拌速度（D）。所以正交試驗(yàn)下得出的海藻酸鈉濃度對(duì)益生菌微膠囊的包埋率影響最大，為最重要的影響因素，其次是乳清蛋白，然后是氯化鈣，最后是攪拌速度。理論上的最佳組合為A2B3C1D3。即海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，攪拌速度800 r/min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 兩歧雙歧桿菌益生菌微膠囊在模擬胃液中的存活率

未經(jīng)包埋的兩歧雙歧桿菌在模擬胃液中150 min基本全部死亡，兩歧雙歧桿菌對(duì)外界環(huán)境敏感，胃液中的低酸環(huán)境使得未經(jīng)處理的兩歧雙歧桿菌細(xì)胞難以存活。相比于未經(jīng)包埋的兩歧雙歧桿菌，雙層包埋能夠顯著地提高益生菌在模擬胃液中的存活率。雙層包埋的兩歧雙歧桿菌在經(jīng)過150 min的人工胃液處理后，存活率達(dá)到70%以上，說明雙層包埋對(duì)保護(hù)兩歧雙歧桿菌耐胃酸效果較好。

圖5 微膠囊在模擬胃液中的存活情況

2.4 益生菌微膠囊在模擬腸液中的釋放性

隨著微膠囊在人工腸液處理的時(shí)間延長，微膠囊包埋的兩歧雙歧桿菌會(huì)連續(xù)釋放，其在人工腸液處理中處理60 min之后，菌體的存活率變化不大，在9 log CFU/mL左右，表明試驗(yàn)的微膠囊腸液溶性較好，60 min之后，兩歧雙歧桿菌就會(huì)被連續(xù)地釋放出來，為膠囊能靶向地產(chǎn)生益生效果鋪墊基礎(chǔ)。

圖6 微膠囊在模擬腸液中的釋放情況

2.5 益生菌微膠囊產(chǎn)品儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將益生菌微膠囊置于4 ℃條件下進(jìn)行保藏，每隔7 d取樣計(jì)活菌數(shù)，經(jīng)微膠囊技術(shù)包埋的兩歧雙歧桿菌和未包埋的兩歧雙歧桿菌活菌數(shù)會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于經(jīng)過微膠囊化處理，兩歧雙歧桿菌外面包覆一層高分子囊膜，使其與外界環(huán)境隔離，增強(qiáng)了對(duì)不良環(huán)境的抵抗力，在儲(chǔ)藏過程中不易失去活性，故菌體存活率較高，膠囊的貯存穩(wěn)定性較好。微膠囊技術(shù)明顯地提高兩歧雙歧桿菌的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

圖7 益生菌微膠囊4 ℃的儲(chǔ)藏試驗(yàn)

3 結(jié)論

研究利用海藻酸鈉和乳清蛋白復(fù)合包埋技術(shù)，能夠高效地包埋益生菌。以包埋率為指標(biāo)，通過優(yōu)化制備條件，海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，攪拌速度800 r/min，在此條件下包埋率達(dá)到78.0%±2.0%。制備的微膠囊在胃液中具有良好耐酸性，在腸液中具有良好釋放性，并且具有貯存穩(wěn)定性，有助于解決益生菌不耐胃酸與不易保存的問題。試驗(yàn)結(jié)果不僅可以提高益生菌在應(yīng)用過程中的菌體存活率，而且為益生菌微膠囊的工藝優(yōu)化提供理論和實(shí)踐依據(jù)。