貫筋藤蛋白酶水解檳榔江水牛酪蛋白制備抗菌肽

趙瓊，李素梅，陳昌航，段松，黃艾祥*

云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院（昆明 650201）

檳榔江水牛是中國唯一的河流型水牛品種，主要分布在云南省保山市騰沖縣的檳榔江流域，在當?shù)胤Q為“嘎拉?！被颉案吕！盵1]。水牛奶無膻腥味，清香可口，干物質(zhì)、脂肪和蛋白質(zhì)含量均高于荷斯坦牛乳[2]。乳蛋白營養(yǎng)豐富，其中酪蛋白含量約為80%，而且酪蛋白作為一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，有著廣泛用途，如焙烤食品中蛋白質(zhì)的強化、人造奶油的增稠和酪蛋白源功能活性肽的制備等[3]。

近年來，抗生素濫用導致細菌的耐藥性增加問題成為全球公共衛(wèi)生難題，因此尋找傳統(tǒng)抗生素的替代品迫在眉睫?？咕模ˋMPs），是能清除體內(nèi)突變細胞和抵御外界微生物侵害的一類小分子短肽，具有廣譜抗菌活性、協(xié)同抗菌作用、抗病毒活性等功能[4]。不同于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽是通過物理作用造成細胞膜的穿孔而達到廣譜的抗菌效果，因此不易產(chǎn)生抗藥性和交叉抗性[5]。由于酪蛋白是牛乳蛋白的主要成分，可利用酶解技術(shù)來制備抗菌活性肽。根據(jù)酶自身的特性，將酶解技術(shù)應用于外源性抗菌肽的制備是獲得大量抗菌肽最有前途的方法，且該技術(shù)還具有低成本、高安全性、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[6-7]。貫筋藤蛋白酶，一種新型、耐高溫的植物凝乳酶，屬于半氨酸蛋白酶家族[8]，可用于奶酪[9]及乳餅[10]生產(chǎn)，將其應用于水牛奶酪蛋白的酶解上有望獲得新型功能活性肽。Ripolles等[11]利用凝乳酶、胃蛋白酶水解牛乳乳鐵蛋白制備抗菌肽并研究其對單增李斯特氏菌的抑菌效果。成希飛等[6]利用胰蛋白酶酶解南方水牛奶，以獲得具有抗菌性的酶解產(chǎn)物，結(jié)果表明抗菌肽復合物對大腸桿菌的抑菌率81.34%。

試驗利用貫筋藤蛋白酶水解檳榔江水牛酪蛋白來制備抗菌肽，在單因素試驗基礎上利用響應面試驗優(yōu)化酶解工藝，并應用SDS-PAGE檢測貫筋藤蛋白酶是否能有效地水解酪蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮水牛乳（云南省保山市騰沖縣）；大腸埃希氏菌CICC 10003（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；檸檬酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；考馬斯亮藍（G-250，美侖生物有限公司）；TRIS、SDS、Glycerol、ammonium persulphate、acrylamide、TEMED（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

TLG20M臺式高速冷凍離心機（長沙邁佳森儀器設備有限公司）；HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司）；BIO-RAD Mini電泳儀（美國伯樂）；MS-100金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司）；ZQLY-180S立式全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白的制備工藝

新鮮水牛奶→4 ℃預冷→低溫離心脫脂（4 000 r/min，20 min）→調(diào)節(jié)至pH 4.6（0.2 mol/L檸檬酸）→攪拌→低溫離心（4 000 r/min，20 min）→棄上清液→清洗沉淀3次→滅酶（沸水，10 min）→調(diào)至pH 7.0（1 mol/mL NaOH）→真空冷凍干燥→-20 ℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 酶解時間

配制20 mg/mL酪蛋白溶液（0.05 mol/L pH 8.5，Tris-HCl緩沖液），酶底比為1∶50（E/S，質(zhì)量比），于50 ℃條件下分別酶解1，2，3，4，5和6 h，酶解結(jié)束后于沸水滅酶10 min，離心（10 000 r/min，15 min）棄沉淀，保留上清液，即為酶解液。分別測定酶解液的抑菌活性，從而篩選出最佳酶解時間。

1.2.2.2 酶解溫度

固定最佳酶解時間，配制20 mg/mL酪蛋白溶液，按酶底比為1∶50（E/S，質(zhì)量比），在不同酶解溫度（40，45，50，55，60，65和70 ℃）下酶解。

1.2.2.3 酶底比

固定最佳酶解時間和酶解溫度，配制20 mg/mL酪蛋白溶液，在不同酶底比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100和1∶125（E/S，質(zhì)量比））條件下酶解。

1.2.3 抑菌活性測定

1.2.3.1 大腸桿菌的活化[12]

將-80 ℃凍存的大腸桿菌接種至LB肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2次，將活化后菌懸液于PCA瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)。

1.2.3.2 活性測定

采用濾紙片法測定抑菌活性[13]。將活化后的菌懸液用生理鹽水梯度稀釋至濃度106CFU/mL，LB瓊脂培養(yǎng)基滅菌后每皿倒25 mL，待培養(yǎng)基凝固后，取200 μL菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基上，待菌液晾干后，每皿貼上4片濾紙片（直徑6 mm），取8 μL樣液（經(jīng)0.22 μm濾膜過濾器過濾）于濾紙片上，超純水作空白對照。于4 ℃條件下放置2 h，待樣液吸附完全后[14]，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱為37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，測量其抑菌圈直徑。每組試驗重復3次。

1.2.3.3 抑菌圈直徑的計算方法[15]

1.2.4 響應面設計

基于單因素試驗結(jié)果，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，對顯著影響酶解制備抗菌肽的3個因素酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶底比（C）做三因素三水平響應面分析試驗（表1）。

表1 響應面試驗因素與水平設計表

1.2.5 SDS-PAGE電泳

利用SDS-PAGE反應貫筋藤蛋白酶對酪蛋白大分子的水解情況。參照文獻[16]方法稍作修改：制膠（15%分離膠、4%濃縮膠）→樣品處理（樣品與上樣緩沖液比例1∶1，混勻，金屬浴95 ℃處理10 min，10 000 r/min離心2 min）→上樣（每孔上樣量10～20 μL）→電泳（50 V，30 min調(diào)至120 V，約90 min）→固定（30%甲醇，30 min）→過夜考染[17]→脫色（脫色至條帶清晰）→拍照→Image Lab軟件分析膠片。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行處理，Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優(yōu)化分析，Image Lab軟件分析電泳膠片。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對抑菌效果的影響

由圖1可知，酪蛋白酶解液對大腸桿菌的抑制效果隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在酶解時間為4 h時其抑菌效果最佳。在酶解1～4 h過程中，酶解液的抑菌效果逐漸增強，原因可能是隨著酶解進行，酪蛋白大分子逐漸釋放出具有抑菌活性的小分子肽，故出現(xiàn)抑菌效果增強現(xiàn)象。而隨著酶解時間的增長（＞4 h），酶解液的抑菌活性出現(xiàn)下降趨勢，可能是酶解液中具有抑菌活性的小分子肽被進一步水解，抑菌活性基團被破壞導致酶解液抑菌活性減弱[18]。因此為了防止水解過度，在制備酪蛋白抗菌肽時應嚴格控制水解時間。綜上所述，選擇4 h為最佳的酶解時間。

圖1 酶解時間對抑菌效果的影響

2.1.2 酶解溫度對抑菌效果的影響

根據(jù)酶的特性，在酶發(fā)揮其酶解催化作用時，酶的作用條件（如：溫度）與酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有著密不可分的聯(lián)系[19]。蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，如果反應溫度超過某一極限，極易引起次級鍵解離，就會導致蛋白酶喪失或部分喪失催化活性；但如果反應溫度過低，就會大大降低體系內(nèi)分子運動激烈程度，從而降低蛋白酶與底物的碰撞幾率[20]。試驗將溫度設在40～70 ℃范圍內(nèi)來篩選最佳酶解溫度。由圖2可知，隨著溫度的升高酶解液的抑菌效果呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在溫度為55 ℃時，酶解液的抑菌效果最佳。綜上所述，選擇55 ℃為最佳的酶解溫度。

圖2 酶解溫度對抑菌效果的影響

2.1.3 酶底比對抑菌效果的影響

由圖3可知，隨著酶底比（E/S）減小酶解液的抑菌圈直徑呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但當E/S＜1/50之后，酶解液的抑菌活性就逐漸減小。因而選擇1∶50為最佳酶底比。酶濃度與底物濃度之比，比酶濃度本身能更好地反應酶解過程中的反應速度特征[21]。當?shù)孜餄舛纫欢?，而增加的酶量又未使底物濃度飽和時，則E/S越大，反應速度也越快，蛋白質(zhì)的水解率也越高；但E/S過大，水解率也隨之過大，底物中的大分子蛋白迅速減少，小分子肽迅速增加，同時肽也會被過剩的酶進一步水解成分子量更低且沒有生物活性的一些寡肽或氨基酸，也有可能導致酶自身相互水解，使酶活力降低[22-23]。

圖3 酶底比對抑菌效果的影響

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面分析方案及結(jié)果

目前，Box-Behnken響應面設計被廣泛地應用于一些工藝條件篩選的研究中[24-25]。試驗根據(jù)Box-Behnken響應面設計的中心組合試驗設計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選擇酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶底比（C）3個影響因素，各取3個水平，采用三因素三水平的響應面分析方法對水解條件進行優(yōu)化設計，共17個試驗點，中心點試驗重復5次。試驗因素與水平設計見表2，回歸方差分析見表3。

由表3方差分析表可知方差失擬項不顯著（p=0.239 2＞0.05），說明回歸方程不失擬，表明所選模型合適，可以用此模型來擬合試驗；方程模型極顯著（p=0.003 5＜0.01），說明多元回歸方程能較好地擬合試驗結(jié)果。綜上所述，Box-Behnken試驗設計可靠，模型可用于貫筋藤蛋白酶水解檳榔江水牛乳酪蛋白制備抗菌肽的理論預測。在此模型中，回歸系數(shù)的顯著性顯示平方項C2的影響達到顯著水平；交互項BC、平方項A2、B2的影響均達到極顯著水平；各因素對酶解液抑菌圈直徑影響的順序為：酶解溫度＞酶底比＞酶解時間。軟件擬合出的二次多項回歸方程為：抑菌圈直徑（Y）=10.44+0.038A-0.47B-0.31C-0.10AB+0.48AC+1.25BC-1.53A2-1.81B2-0.88C2。

2.2.2 響應面分析結(jié)果

響應曲面圖能直觀反映各個因素與響應值之間的關(guān)系、兩因素間交互作用的顯著性，坡度的陡峭程度，表明響應值對于處理條件改變的敏銳性，等高線的形狀則反映各因素交互是否顯著，圓形等高線表示交互不顯著[26-27]。圖4～圖6為3個因素對酶解酪蛋白制備抗菌肽抑菌效果的交互作用。由圖4～圖6可知，隨著酶解時間延長、酶解溫度升高，隨著酶解時間延長、酶底比升高，隨著酶解溫度、酶底比升高，酶解液的抑菌圈直徑呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與單因素的試驗結(jié)果一致。但圖4和圖5等高線呈圓形，說明酶解時間和酶解溫度、酶解時間和酶底比的交互作用不顯著，而圖6等高線圖呈圓形，說明酶解溫度和酶底比的交互作用顯著。

表2 響應面分析方案及結(jié)果

表3 酶解液抑菌圈直徑回歸模型方差分析表

圖4 酶解時間和溫度交互作用對酶解液抑菌圈直徑影響的3D響應面圖和等高線圖

圖5 酶解時間和酶底比交互作用對酶解液抑菌圈直徑影響的3D響應面圖和等高線圖

圖6 酶解溫度和酶底比交互作用對酶解液抑菌圈直徑影響的3D響應面圖和等高線圖

2.2.3 最佳抗菌肽制備工藝驗證試驗

根據(jù)響應面法優(yōu)化分析，貫筋藤蛋白酶水解檳榔江水牛酪蛋白制備抗菌肽最佳工藝條件為酶解時間4.67 h、酶解溫度54.01 ℃、酶底比1∶46.61，抑菌圈預測值為9.83 mm。為了驗證此模型預測的準確性，且考慮試驗操作工作中的可操作性，固設定待驗證的酶解工藝參數(shù)為：酶解時間4.5 h、酶解溫度54 ℃、酶底比1∶45。在此條件下進行3次平行驗證試驗。結(jié)果表明，在此條件下酶解液對大腸桿菌抑菌圈直徑為10.42±0.46 mm，與預測值相近（預測值為9.83 mm），說明此模型優(yōu)化的工藝準確可靠，具有實際應用價值。

2.3 SDS-PAGE分析酪蛋白降解情況

圖7 SDS-PAGE分析酪蛋白降解情況

SDS-PAGE用于蛋白質(zhì)純度及分子量的檢測，也可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小變化觀察其降解情況[28]。由圖7可以看出，在最佳酶解條件下（溫度54 ℃、時間4.5 h、酶比底1∶45）酪蛋白明顯被降解，酶解液的分子量在15 kDa以下。Abdel-Hamid等[29]研究發(fā)現(xiàn)駱駝乳清蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解240 min后，電泳圖譜顯示所有乳清蛋白組分完全被水解，抑菌活性驗證發(fā)現(xiàn)水解釋放出了具有抑菌活性的肽。因此，試驗的電泳圖譜表明貫筋藤凝乳酶能有效水解檳榔江水牛酪蛋白，結(jié)合抑菌活性測定表明酶解產(chǎn)物中可能含有小分子抗菌活性肽。

3 結(jié)論

通過單因素和響應面優(yōu)化檳榔江水牛酪蛋白源抗菌肽的酶解制備工藝，最佳工藝為：水解時間4.5 h、酶底比1∶45、酶解溫度54 ℃。在此條件下酶解液對大腸桿菌的抑菌圈直徑為10.42±0.46 mm，SDSPAGE可看出大分子酪蛋白已被完全水解成為小分子肽。此研究為檳榔江水牛奶進一步開發(fā)利用提供了參考，并為此抗菌肽的分離純化及抑菌機制研究奠定了基礎。