響應(yīng)面法優(yōu)化黃精總蛋白提取工藝及其氨基酸含量

王遠(yuǎn)茜，陳艷艷，宋宸宇，白雪媛，王思明*

1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)（長春 130117）；2. 吉林省腫瘤醫(yī)院康復(fù)中心（長春 130012）

黃精（Polygonatum sibiricumRed.）為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）滇黃精、多花黃精的干燥根狀莖。按其形狀，通常又被稱為雞頭黃精、仙人余糧、老虎姜等。自然條件下，黃精最適合生長于表層水分豐富、富含腐蝕質(zhì)的沙質(zhì)土壤以及蔭蔽高海拔地區(qū)[1]。

藥用黃精在藥食同源方面以及健康保健領(lǐng)域的作用愈發(fā)突出，具備廣泛的藥用價(jià)值、重要的研究意義。較多報(bào)道針對黃精多糖等[2-5]成分進(jìn)行研究，中醫(yī)古籍記載鮮黃精具有補(bǔ)益作用，因此考察黃精總蛋白是否具有一定的生物學(xué)活性。此次試驗(yàn)主要考察報(bào)道較少的黃精蛋白提取工藝[6]?；诨A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，在堿提液中黃精蛋白的溶出率較水提液高，試驗(yàn)采用堿液提取的方法提取黃精總蛋白，因此試驗(yàn)從pH為7開始考察，所得出的試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

響應(yīng)面方法（Response surface methology，簡稱RSM）是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，是用來對所感興趣的響應(yīng)受多個(gè)變量影響的問題進(jìn)行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化該響應(yīng)值。比正交試驗(yàn)的方法更加可信、詳細(xì)與準(zhǔn)確[7]。

1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1 材料與試劑

鮮黃精（湖南湘西）；NaOH（北京化工廠，分析純）；HCl（北京化工廠，分析純）；Bradford蛋白定量試劑盒（天根，TIANGEN）；磷酸鹽緩沖液（PBS，由長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)中心配制）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì)（美國梅特勒-托利多公司）；Gentrifuge 5804R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；AL204電子天平（美國梅特勒-托利多公司）；全營養(yǎng)蔬果破壁機(jī)；電子精密分析天平。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。將牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別吸取0，1，2，3，4，5和6 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，使用酶標(biāo)儀來測定吸光度，以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。所建立的回歸方程為：Y=0.077 9X+0.008 3（R2=0.998 4）。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 黃精蛋白單因素試驗(yàn)

以黃精蛋白提取率為衡量指標(biāo)，分別以pH、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為影響因素以設(shè)計(jì)黃精蛋白單因素試驗(yàn)[8]。

2.2.1 黃精蛋白等電點(diǎn)的確定

精密稱取黃精6份，每份20.00 g，按料液比1∶5（g/mL）將堿提取液（pH 9）放置于4 ℃冰箱浸提，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，酸沉4 h[9]，提取次數(shù)1次，沉淀離心后凍干，分別稱定不同pH條件下各個(gè)樣品蛋白質(zhì)的含量，含量最多的即為等電點(diǎn)，試驗(yàn)中酸沉的pH 3.5為黃精的等電點(diǎn)[10]。

由圖2可以看出，當(dāng)pH＜3.5時(shí)，蛋白提取率隨著pH的增加而逐漸上升；當(dāng)pH為3.5時(shí)，黃精蛋白含量最高，此時(shí)酸沉效果最好；當(dāng)pH＞3.5時(shí)，隨著pH的增加，蛋白質(zhì)的提取率降低。綜上可知，pH 3.5為黃精的等電點(diǎn)[11]。

圖2 等電點(diǎn)pH與提取率的關(guān)系

2.2.2 堿提pH對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在料液比1∶5（g/mL），pH分別為7，8，9，10和11的條件下放置于4 ℃冰箱浸提4 h，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，然后使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[12]。

由圖3可知，蛋白質(zhì)的提取率在pH 9時(shí)最高，在pH 9之前蛋白提取率隨著pH增大而增加，pH 10時(shí)所提取蛋白含量減少，故選擇pH 9作為最后提取的pH。

圖3 堿液pH與提取率的關(guān)系

2.2.3 料液比對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比分別為1∶3，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）的條件下放置于4℃冰箱浸提4 h，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，蛋白質(zhì)含量使用考馬斯亮藍(lán)法測定。

由圖4可知，料液比1∶5（g/mL）時(shí)蛋白提取率最高，之后隨著提取液體積增大提取率逐漸下降[13]。

2.2.4 提取時(shí)間對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的條件下，分別堿提2，4，8，12和24 h，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，然后使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。

由圖5可以明確看出，當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)，黃精蛋白提取效果最好。在4 h前，黃精蛋白隨著提取時(shí)間延長溶出較多，在4 h時(shí)達(dá)到最大，4 h后的提取率逐步趨于平緩，分析原因可能是隨著提取時(shí)間的增長[14]，有效成分溶出量達(dá)到飽和，故試驗(yàn)選擇4 h作為最佳提取方案。

圖4 不同料液比對提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對提取率的影響

2.2.5 提取次數(shù)對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的條件下堿提4 h，分別提取1，2和3次，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，蛋白質(zhì)含量使用考馬斯亮藍(lán)法測定。

由圖6可以看出，提取2次較提取1次提取率增大，之后隨著提取次數(shù)的增加，蛋白的提取率沒有太大變化，同時(shí)考慮到成本及工作效率的因素，提取次數(shù)確定為2次。

圖6 不同提取次數(shù)對提取率的影響

2.3 蛋白提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Export 8.0.6的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)組合平行3次，提取率取平均值，因素和水平見表1[15]，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每個(gè)樣品處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖和統(tǒng)計(jì)分析。Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

得擬合方程為：Y=+0.81-0.015A+0.021B+0.083C+0.012D+0.022AB-0.013AD+0.000 02BC-0.000 02BD-0.075CD-0.23A2-0.16B2-0.13C2-0.2D2。

該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著性分析見表3。模型F=121.28，Pr＞F＜0.000 1，說明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項(xiàng)F=0.916 4，Pr＞F＞0.05，失擬項(xiàng)相對于純誤差影響不顯著，說明回歸模型與實(shí)測值擬合度較好，可以使用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。各因素的影響大小為：提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞pH。通過F檢驗(yàn)來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，PB、PC均小于0.01，說明提取時(shí)間、提取次數(shù)對黃精蛋白提取率的影響極顯著。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

表4 回歸模型方差分析

2.5 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0.6，根據(jù)回歸方程，生成等高線和響應(yīng)面圖，并考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析pH、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對黃精蛋白提取率的影響。

從圖7～圖12可見，四個(gè)因素在所選范圍內(nèi)存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)。圖10中，CD交互作用顯著，與F值結(jié)果一致。

圖7 提取時(shí)間與提取次數(shù)交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 提取時(shí)間與料液比交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖9 提取次數(shù)與料液比交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖10 提取次數(shù)與pH交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖11 pH與料液比交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖12 pH與提取時(shí)間比交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)軟件分析優(yōu)化，由該模型得到的最佳優(yōu)化條件為：料液比1∶5.587（g/mL）、提取時(shí)間3.494 h、提取次數(shù)1.832次、pH 9.673。且預(yù)測黃精蛋白提取率理論值為0.57%?？紤]到實(shí)際操作的可能性，將試驗(yàn)條件修正為：料液比為1∶5.6（g/mL）、提取時(shí)間3.5 h、提取次數(shù)2次、pH 9.7。在該修正條件下進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，平均蛋白質(zhì)提取率為0.51%，接近理論值。表明該數(shù)學(xué)模型可用于優(yōu)化黃精蛋白質(zhì)提取過程。

2.7 高效液相色譜法測定黃精中氨基酸的方法與結(jié)果

采用高效液相色譜法，對黃精凍干品中所含氨基酸進(jìn)行測定[16]。分別將各種必需或非必需的氨基酸進(jìn)針，通過對比總氨基酸液相圖和黃精蛋白凍干品液相圖相同的保留時(shí)間峰可以得到黃精所含的氨基酸的種類。

2.7.1 色譜條件

色譜柱，GL Sciences WP 300 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A，甲醇；流動相B，0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液。樣品采用梯度洗脫程序，洗脫量見表5。流速1.0 mL·min-1，紫外檢測波長360 nm，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

表5 柱前衍生化高效液相指紋圖譜流動相洗脫程序

2.7.2 供試品溶液的制備

取0.1 g黃精凍干粉，使用流動相溶解黃精凍干粉，精密量取2 mL續(xù)濾液置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風(fēng)烘箱中避光反應(yīng)1 h，取出，冷卻，再加濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.7.3 陰性對照品的制備

精密量取2 mL蒸餾水置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風(fēng)烘箱中避光反應(yīng)1 h，取出，冷卻，再加濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL，定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為衍生劑陰性對照品溶液。

2.7.4 對照品溶液的制備

分別稱取約10 mg各氨基酸對照品，精密稱定，置于10 mL凍干管中，加蒸餾水至10 mL，得到濃度為1 g·L-1的氨基酸對照品溶液。對各氨基酸對照品溶液進(jìn)行衍生化，取2 mL各氨基酸對照品溶液置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風(fēng)烘箱中避光反應(yīng)1 h，取出，冷卻，再加入濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為氨基酸對照品溶液。

圖13 混合氨基酸色譜圖

圖14 黃精色譜圖

圖15 空白色譜圖

由圖13～圖15可以看出，黃精中所含氨基酸有：絲氨酸（保留時(shí)間17.903 min）、蘇氨酸（保留時(shí)間25.335 min）、脯氨酸（保留時(shí)間32.235 min）、纈氨酸（保留時(shí)間53.187 min）、苯丙氨酸（保留時(shí)間58.553 min）、異亮氨酸（保留時(shí)間59.312 min）、亮氨酸（保留時(shí)間60.029 min）和酪氨酸（保留時(shí)間63.904）。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析，對影響因素及其相互作用進(jìn)行探討，優(yōu)化提取黃精蛋白的提取工藝，其最佳條件為料液比為1∶5.6（g/mL）、提取時(shí)間3.5 h、提取次數(shù)2次、pH 9.7。在此修正條件下進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，蛋白質(zhì)提取率的平均值為0.51%，與理論值較為接近，表明該數(shù)學(xué)模型可用于優(yōu)化黃精蛋白質(zhì)提取過程。采用高效液相色譜法分析得出黃精蛋白中含有的氨基酸有絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸。