超聲波-微波聯(lián)合提取綠蘆筍中水溶性粗多糖的工藝優(yōu)化

崔守富，邵家威，郝征紅，王春云，趙德川，岳鳳麗*

山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟(jì)南 250100）

綠蘆筍原產(chǎn)于歐洲，又稱石刁柏，屬百合科天門(mén)冬屬草本植物[1]。綠蘆筍被稱為“蔬菜之王”，筍莖中包含大量人類不可缺少的氨基酸和維生素等物質(zhì)[2-3]，還含有蘆筍多糖[4]、黃酮[5]、皂苷[6]等生物活性物質(zhì)[7]。

超聲波-微波協(xié)同法主要是利用超聲化提供能量使其產(chǎn)生空化效應(yīng)，提高分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑的穿透力[8]；同時(shí)，微波具有便于控制、安全環(huán)保、加熱迅速、高效節(jié)能的特點(diǎn)[9]。通過(guò)二者有效地結(jié)合，能縮短成分溶出時(shí)間、節(jié)省提取成本，顯著提高提取成分的提取得率。目前，對(duì)于利用超聲波-微波協(xié)同提取綠蘆筍多糖的研究較少。主要研究采用超聲波微波聯(lián)合提取方式，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)綠蘆筍中水溶性粗多糖的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合，確定蘆筍多糖提取的最佳提取工藝參數(shù)，為綠蘆筍水溶性粗多糖的加工應(yīng)用提供研究借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠蘆筍老莖：產(chǎn)自福建漳州。無(wú)水乙醇、無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸：分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WZJ-6J振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司；GL-16M冷凍高速臺(tái)式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XO-SM200超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐儀器制造有限公司；UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精天電子儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博涵實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠；XMTO電熱恒溫水浴鍋，廣東施儀儀表公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將新鮮綠蘆筍老莖清洗后，切分小塊于50 ℃下烘干至水分含量約為5%。利用振動(dòng)式超微粉碎機(jī)粉碎至250目，將蘆筍超微粉再次放入烘干箱中干燥2 h，置于密封保鮮袋備用。

1.3.2 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于多糖和濃硫酸發(fā)生水解反應(yīng)，生成單糖脫水生成糠醛，糠醛能與苯酚反應(yīng)生成橙紅色物質(zhì)，故采用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。依次取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 0.1 mg/mL C6H12O6標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管后，補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，然后按照順序依次加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL濃H2SO4后搖勻，靜置2 min，沸水反應(yīng)15 min取出，冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，作回歸分析，得回歸方程：y=8.322 9x-0.009 5，R2=0.997 3。

1.3.3 蘆筍多糖的提取

準(zhǔn)確稱取綠蘆筍老莖超微粉于超聲波-微波聯(lián)用提取皿中，以水作為提取溶劑，進(jìn)行超聲波-微波聯(lián)合提取。提取后在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液20 mL加入4倍無(wú)水乙醇，置于4 ℃條件下醇沉12 h。醇沉后離心（11 000 r/min、4 ℃、10 min）取沉淀，加水復(fù)溶，即得蘆筍粗多糖溶液。

1.3.4 多糖含量測(cè)定

將0.5 mL蘆筍多糖提取液加入到比色管中，再依次加入0.5 mL蒸餾水、5 mL濃H2SO4、1 mL 6%苯酚，搖勻后沸水浴15 min，取出迅速冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蘆筍粗多糖的得率。

式中：Q為多糖得率，%；X為多糖溶液的質(zhì)量濃度，mg；M為樣品干質(zhì)量，mg；K為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；H為樣品體積，mL；Z為定容用提取液體積，mL。

1.3.5 蘆筍多糖提取單因素試驗(yàn)

1) 液料比對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。選取液料比25∶1，30∶1，35∶1，40∶1和45∶1（mL/g），在超聲功率750 W、微波功率800 W、超聲時(shí)間20 min、溫度為65 ℃條件下，研究液料比對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。

2) 超聲功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。分別選用超聲功率750，800，850，900和950 W，在液料比30∶1（mL/g）、微波功率800 W、超聲時(shí)間20 min、溫度為65 ℃的條件下，研究超聲功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。

3) 超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。選用超聲時(shí)間10，15，20，25和30 min，在超聲功率750 W、微波功率800 W、液料比30∶1（mL/g）、溫度為65 ℃的條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。

4) 提取溫度對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。選取提取溫度55，65，75，85和95 ℃，在超聲功率750 W、微波功率800 W、液料比30∶1（mL/g）、超聲時(shí)間20 min的條件下，研究提取溫度對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。

5) 微波功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。分別選用微波功率700，750，800，850和900 W，在超聲功率750 W、提取溫度65 ℃、液料比30∶1（mL/g）、超聲時(shí)間20 min的條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲功率、液料比、超聲時(shí)間、提取溫度、微波功率為考察因素，以蘆筍粗多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。通過(guò)Design Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化蘆筍粗多糖在超聲波-微波協(xié)同提取下的工藝條件。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

液料比對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

如圖1所示，明顯得出，液料比對(duì)多糖得率的影響較大，呈現(xiàn)先上升再略微下降的趨勢(shì)。液料比40∶1（mL/g）時(shí)得率達(dá)到峰值為3.50%。液料比在25∶1～40∶1（mL/g）時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取率逐漸升高。在液料比大于40∶1（mL/g）以后粗多糖得率下降，可能是提取劑與物料的比值增大濃度差也隨之增大，從而影響超聲波的空化效應(yīng)令其得率下降[10]。因此，超聲波微波聯(lián)合提取時(shí)液料比的最佳條件是40∶1（mL/g）。

圖1 液料比對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

2.1.2 超聲功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

超聲功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

如圖2所示，隨著超聲功率的不斷提高，綠蘆筍水溶性多糖的提取得率持續(xù)升高；在超聲波功率達(dá)到900 W時(shí)，多糖得率達(dá)到最高值為3.41%；在超聲功率達(dá)到950 W時(shí)，多糖得率達(dá)到3.39%，與超聲功率達(dá)到900 W時(shí)相差不大，僅僅減少了0.02%。在超聲波功率在750 W時(shí)，為綠蘆筍水溶性粗多糖的最低值為2.82%。由圖可知，最低值與最高值差距明顯，達(dá)到0.59%，故超聲波功率是影響多糖得率的顯著因素。基于節(jié)約能源和環(huán)保的理念，確定為在超聲功率為900 W時(shí)，為超聲波微波聯(lián)合提取的最佳工藝條件。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，在25 min以內(nèi)，水溶性粗多糖的得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大；在25 min以后，多糖得率逐漸有下降的趨勢(shì)。超聲時(shí)間為30 min時(shí)，水溶性粗多糖得率達(dá)到2.68%，下降了0.15%。因此，確定最佳時(shí)間為25 min。

圖2 超聲功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

提取溫度對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

如圖4所示，在提取溫度從55 ℃逐漸增大到85 ℃時(shí)，水溶性粗多糖的得率隨著提取溫度的升高而逐漸提高；在提取溫度達(dá)到85 ℃時(shí)，綠蘆筍中水溶性粗多糖得率達(dá)到最大值，為2.85%。在提取溫度大于85 ℃時(shí)，多糖得率逐漸有下降的趨勢(shì)。因此，在提取溫度為85 ℃時(shí)，超聲波-微波聯(lián)合提取效率最高。由單因素溫度的試驗(yàn)結(jié)果表明蘆筍粗多糖得率的最大值與最小值相差較小，差值僅為0.242%，所以后續(xù)試驗(yàn)舍棄單因素溫度變量，將溫度設(shè)為85 ℃作為可知條件。

圖4 提取溫度對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

2.1.5 微波功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

微波功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

如圖5所示，在微波功率為700～800 W時(shí)，綠蘆筍中水溶性粗多糖得率隨著微波功率的不斷提高而上升，在微波功率達(dá)到800 W時(shí)，綠蘆筍中水溶性粗多糖得率達(dá)到最大，為2.815%。在超聲功率進(jìn)一步上升的過(guò)程中蘆筍中水溶性粗多糖的得率基本無(wú)太大變化，穩(wěn)定在2.8%左右。但是當(dāng)微波功率超過(guò)800 W，進(jìn)一步增大時(shí)，原料中的多糖已經(jīng)被充分提取出來(lái)，多糖得率不會(huì)繼續(xù)升高，但與最大值基本保持平行。

圖5 微波功率對(duì)蘆筍粗多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果

試驗(yàn)研究超聲功率、微波功率、液料比、超聲時(shí)間，4個(gè)單一因素對(duì)綠蘆筍水溶性粗多糖得率的影響，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)出29個(gè)試驗(yàn)，5個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)用來(lái)預(yù)測(cè)試驗(yàn)的誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，見(jiàn)表3。

利用Design-Expert軟件分析數(shù)據(jù)，超聲功率、微波功率、液料比、超聲時(shí)間與蘆筍多糖得率之間的二次回歸方程為：Y=4.26+0.12A+0.62B+0.021C+0.031D+0.030AB-0.018AC-0.28AD-0.043BC-0.042BD-0.25CD-0.28A2-0.35B2-0.40C2-0.12D2。通過(guò)表2分析可知，回歸模型極顯著（p＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.1），說(shuō)明回歸模型與實(shí)際情況擬合吻合度較高，試驗(yàn)產(chǎn)生的誤差較小，可以使用此模型對(duì)綠蘆筍老莖中多糖提取得率進(jìn)行模擬分析和預(yù)測(cè)；在此模型中A，A2，B2，C2都顯著差異（p＜0.000 1），即超聲功率、超聲功率二次方項(xiàng)、微波功率二次方項(xiàng)、液料比二次方項(xiàng)對(duì)多糖得率具有顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)由軟件得到圖6。

通過(guò)響應(yīng)面垂直曲面的陡峭程度可以直觀反應(yīng)因素之間交互作用對(duì)蘆筍多糖提取得率的影響，等高線的等高差額可以反映各因素之間交互作用的強(qiáng)弱。根據(jù)圖6分析，根據(jù)陡峭程度從高到低程度為超聲功率＞液料比＞微波功率＞超聲時(shí)間，因此，各因素對(duì)蘆筍多糖提取得率影響順序?yàn)槌暪β剩疽毫媳龋疚⒉üβ剩境晻r(shí)間。以上分析皆同試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鼋Y(jié)論相吻合。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢測(cè)

圖6 各因素兩兩交互影響響應(yīng)曲面

2.2.3 蘆筍水溶性粗多糖提取工藝條件的確定與驗(yàn)證

為了進(jìn)一步改進(jìn)蘆筍水溶性粗多糖的提取最佳試驗(yàn)條件，利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)結(jié)果蘆筍水溶性的粗多糖提取的最優(yōu)試驗(yàn)參數(shù)為：超聲波功率936.23 W、液料比41.60∶1（mL/g）、微波功率807.96 W、超聲時(shí)間20 min。在這個(gè)最優(yōu)條件下，綠蘆筍水溶性粗多糖的得率的預(yù)測(cè)值為4.30%。由于考慮到試驗(yàn)儀器的超聲波功率和微波功率設(shè)置的精準(zhǔn)度，將最優(yōu)參數(shù)條件設(shè)定為超聲功率936 W（儀器最大功率的78%）、液料比42∶1（mL/g）、微波功率804 W（儀器最大功率的67%）、超聲時(shí)間20 min，該條件測(cè)得的綠蘆筍水溶性粗多糖的得率是4.23%。說(shuō)明該模型對(duì)蘆筍多糖提取條件擬合較好，得到的優(yōu)化條件可行。

3 結(jié)論

以綠蘆筍老莖為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，得出超聲波功率936 W、液料比42∶1（mL/g）、微波功率804 W、超聲時(shí)間20 min，在此條件下，得到蘆筍多糖得率為4.23%。研究結(jié)果表明，綠蘆筍老莖中的多糖具有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值，為進(jìn)一步研究蘆筍多糖提供了理論基礎(chǔ)。