聚乙二醇/(NH4)2SO4雙水相萃取香菇多糖中蛋白質(zhì)

王瑩，邢曉玲，李嶼君，王思怡，仲菲

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院（泰州 225300）

香菇又稱為香菌、花菇、香蕈，是一種藥食同源的中藥材，用于治風(fēng)破血、化痰理氣、益味助食、能夠預(yù)防佝僂病、抑制癌細(xì)胞的生長[1-3]。香菇的有效成分主要包括香菇多糖、香菇嘌呤、微量元素等[4]。香菇多糖是香菇的主要活性成分，具有降血糖、抗氧化，抗病毒等藥理活性，能夠調(diào)節(jié)免疫功能，刺激干擾素形成，在臨床上具有較好的研究前景[5-9]。熱水浸提法是香菇多糖的傳統(tǒng)提取方法[10]，此方法不僅可提出多糖，其他可溶性成分如蛋白質(zhì)也會被提取出來，而多糖的藥效與其純度關(guān)系較大，因此，提取純度較高的香菇多糖具有重要的意義。有關(guān)香菇的開發(fā)利用多集中于子實(shí)體部分，香菇柄占香菇總質(zhì)量的30%左右，其營養(yǎng)活性成分的含量豐富，但因香菇柄纖維化程度高，咀嚼性差，在加工過程中沒有被充分利用，造成資源浪費(fèi)。采用聚乙二醇（PEG）-(NH4)2SO4雙水相體系將香菇柄水提液中的多糖與蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，通過單因素和正交試驗(yàn)探索蛋白質(zhì)的最佳萃取參數(shù)，為香菇多糖的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄（河南省南陽市雷氏菇品購銷有限公司，將香菇柄烘干，粉碎，過20目篩，備用）。

葡萄糖對照品、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為市售分析純。

①蘇軾《卜算子》(缺月掛疏桐)：雙調(diào)44字，上闋4句2仄韻，下闋4句2仄韻。句式：5575。5575。

1.2 儀器與設(shè)備

梅特勒-托利多AL204電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；JJ-1精密增力電動攪拌器（國華電器有限公司）；XMTD-8222電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；HK-02A多功能粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）；80-2臺式電動離心機(jī)（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

1.3 方法

感恩節(jié)(Thanksgiving Day)是美國人民獨(dú)創(chuàng)的一個古老節(jié)日，也是美國人合家歡聚的節(jié)日。初時(shí)感恩節(jié)沒有固定日期，由美國各州臨時(shí)決定。直到美國獨(dú)立后的1863年，林肯總統(tǒng)宣布感恩節(jié)為全國性節(jié)日。1941年，美國國會正式將每年11月第四個星期四定為“感恩節(jié)”。感恩節(jié)放假一天，但很多地方會將假期延長到星期天。

稱取35 g香菇柄粉放入圓底燒瓶中，加500 mL蒸餾水，于50 ℃水浴鍋中攪拌提取約2 h，抽濾得到香菇柄水提液，放入冰箱4 ℃保存。

1.3.2 香菇柄水提液中蛋白質(zhì)與多糖濃度的測定

“張夢華，如果你對30萬元代孕費(fèi)還不滿意的話，我們也可以再加錢，你說多少錢都沒問題。”陳清小心地說道。

1.3.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

今天，我國的物流業(yè)多項(xiàng)指標(biāo)已經(jīng)排名在世界前列，論規(guī)模已經(jīng)成為世界物流大國。據(jù)了解，中國的物流市場已經(jīng)達(dá)到12萬多億元，這已經(jīng)超出美國的9萬多億元，論市場規(guī)模已經(jīng)成為世界第一。

1.3.1 香菇柄水提液的制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[11]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量。以吸光度（y）對蛋白質(zhì)濃度（x）回歸，得回歸方程為y=0.003 5x-0.005 2（R2=0.995 6），表明在40～200 μg/mL范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸顯色法測定多糖的濃度，以吸光度（y）對葡萄糖濃度（x）回歸，得回歸方程為y=0.014 2x-0.006 9（R2=0.996 5），表明在10.56～52.8 μg/mL范圍內(nèi)葡萄糖濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)的含量測定

精密移取1.00 mL香菇柄水提液于容量瓶中，按照1.3.2.1測算出蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度179.49 μg/mL，后續(xù)試驗(yàn)均采用此濃度的香菇水提液。

1.3.3 蛋白質(zhì)的萃取及含量測定

選用濃度18%的PEG 4000和17%(NH4)2SO4的雙水相體系，分別加入0，1%，2%，3%和4%的NaCl，調(diào)至pH 6.0，在每個刻度離心管中分別加入5.00 mL香菇水提液，搖勻，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，離心萃取30 min。

蛋白質(zhì)的萃取率（E）按式（1）求得。

③水利設(shè)施水毀嚴(yán)重。洪水損壞堤防1 859km、護(hù)岸940處、水庫300座、水電站50座，沖毀塘壩98座，損壞水閘649座，損壞灌溉設(shè)施7 179處，水利直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)54億元。

由圖3可知，隨著PEG 4000濃度增大，Y變化不大，E先增大后減小，這是因?yàn)?NH4)2SO4濃度一定時(shí)，增大PEG 4000濃度，會使體系中成相物質(zhì)的總濃度增加，萃取相的極性減小，而蛋白質(zhì)是具有部分極性的非極性物質(zhì)，故其在萃取相中的溶解度隨之增加，從而使E不斷增加[14]。PEG 4000濃度太高，可能會使萃取相中的極性降低太多，從而使(NH4)2SO4的溶解度降低而增加體系黏度，阻止相間分子的轉(zhuǎn)移，使蛋白質(zhì)滯留在兩相之間，導(dǎo)致E減小。因此，PEG 4000的最佳濃度為18%。

式中：ct1和cb1分別為萃取完全后蛋白質(zhì)在上相（PEG相）和下相（硫酸銨相）中的質(zhì)量濃度，μg/mL；Vt和Vb分別為雙水相上相和下相的體積 ，mL。

親水性聚合物PEG和硫酸銨在水中形成兩相的原因是由于聚合物的不相容性或鹽析，只有當(dāng)這兩種物質(zhì)在水相中達(dá)到一定濃度時(shí)，才能形成兩相[13]。圖1顯示，由不同分子量的PEG和(NH4)2SO4組成的兩相系統(tǒng)。PEG的平均分子量越大，雙結(jié)線越接近原點(diǎn)，相臨界濃度越低。

式中：ct2和cb2分別為萃取完全后多糖在上相（PEG相）和下相（硫酸銨相）中的質(zhì)量濃度，μg/mL；Vt和Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL。

對流動相的流速和柱溫進(jìn)行了優(yōu)化選擇。選擇0.8，1.0，1.2 mL/min這3種不同的流速來考察10種酚類物質(zhì)的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，流速為0.8 mL/min時(shí)，1-萘酚的保留時(shí)間為25.80 min，保留時(shí)間較長；流速為1.2 mL/min時(shí)，香草醛與苯酚沒有達(dá)到基線分離；1.0 mL/min時(shí)，1-萘酚的保留時(shí)間為24.275 min，香草醛與苯酚的分離度較大。綜合考慮保留時(shí)間和分離效果，最終選擇1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系相圖

香菇多糖回收率（Y）按式（2）求得。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相圖

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.2 PEG 4000濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

稱取同等質(zhì)量的PEG 1500、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000于5個刻度離心管中，固定PEG濃度18%，(NH4)2SO4濃度17%，調(diào)pH 6.0，在每個刻度離心管中分別加入5.00 mL香菇水提液，搖勻，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，離心萃取30 min。

由圖2可知，隨著PEG分子量增大，E和Y均先增大后減少。即在PEG 4000的雙水相系統(tǒng)中，多糖回收率Y和蛋白質(zhì)萃取率E達(dá)到最高，故試驗(yàn)選用分子量4 000的聚乙二醇。

圖2 不同分子量PEG對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.1 PEG的分子量對蛋白質(zhì)萃取率的影響

以電動牙刷為例。電動牙刷的問世已經(jīng)有一段時(shí)間了，對其的評價(jià)也是褒貶不一，筆者也是用了好幾年的點(diǎn)用牙刷了，首先先談一談它的好處。曾經(jīng)醫(yī)學(xué)上推出了巴氏刷牙法，能真正的對牙齒進(jìn)行清潔，但其實(shí)很難做到，而電動牙刷可以達(dá)到比巴氏刷牙法更好的效果，幾乎大部分人都因清潔度不夠而有牙結(jié)石；其次，有相當(dāng)一部分人患有牙齦出血、牙周炎等疾病，牙齦出血實(shí)質(zhì)是牙結(jié)石、牙菌斑在刺激牙齦，引發(fā)牙齦發(fā)炎、紅腫出血，電動牙刷能比手刷更多清除牙菌斑，預(yù)防此類口腔疾病。

固定(NH4)2SO4濃度為17%，調(diào)節(jié)PEG 4000濃度分別為14%，16%，18%，20%和22%，調(diào)pH 6.0，在每個刻度離心管中分別加入5.00 mL香菇水提液，搖勻，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，離心萃取30 min。

在距離較長的貫通隧道上方鉆孔，對埋深度較低的隧道進(jìn)行傳統(tǒng)坐標(biāo)的雙導(dǎo)線布設(shè)，使用全站儀、垂準(zhǔn)儀等安置在地鐵中，其具體技術(shù)操作流程為，使用雙頭點(diǎn)、雙定向的方法，可以提高測量的精準(zhǔn)度，獲得準(zhǔn)確的定向測量的坐標(biāo)，或者使用導(dǎo)線，定向地鐵測量方法，保持儀器設(shè)備的定向安置以及合理組合，適用于場地較為狹小的地鐵施工路段。在多種施工環(huán)境的地鐵施工環(huán)境下，這是一種定向測量方法，應(yīng)有一個起算控制點(diǎn)作為中線控制點(diǎn)，通過原有施工中線控制點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)絡(luò)線結(jié)網(wǎng)等的鋪設(shè)，可以保持測量精度的優(yōu)勢。

圖3 PEG 4000濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.3 (NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

固定PEG 4000濃度18%，調(diào)節(jié)(NH4)2SO4濃度分別為13%，15%，17%，19%和21%，調(diào)至pH 6.0，在每個刻度離心管中分別加入5.00 mL香菇水提液，搖勻，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，離心萃取30 min。

由圖4可知，隨著(NH4)2SO4濃度增加，多糖回收率Y始終維持在較高水平，E先增大后減少。這是因?yàn)?NH4)2SO4濃度越大，無機(jī)鹽的鹽析作用越強(qiáng)，蛋白質(zhì)在PEG 4000里的濃度越高，E增大，但(NH4)2SO4濃度過大時(shí)，無機(jī)鹽影響蛋白質(zhì)表面疏水性，反而使E減少[15]。因此，(NH4)2SO4最佳濃度為17%。

學(xué)校對學(xué)生的德育教育離不開思想品德課。所以更應(yīng)該加強(qiáng)師資隊(duì)伍的建設(shè)，加強(qiáng)對思想品德課的重視。德育教育的發(fā)展才走出了一小步，未來的輝煌需要我們共同筑造。在信息技術(shù)高速發(fā)展的今天，德育教育的方式還需要不斷探索，做好學(xué)生的思想道德建設(shè)，不僅需要學(xué)校的努力，還需要家庭的配合以及國家的大力支持。只有在各方的共同努力之下，學(xué)生的素質(zhì)教育才能得到質(zhì)的飛躍，德育教育才能取得累累碩果。

圖4 (NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.4 NaCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

稱取一定質(zhì)量的PEG于刻度離心管中，固定PEG和(NH4)2SO4的濃度，調(diào)節(jié)pH，加入5.00 mL香菇水提液，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速固定為2 000 r/min。待兩相完全分離后，分別讀取上相和下相的體積，用苯酚-硫酸顯色法和考馬斯亮藍(lán)法分別測定上、下兩相中多糖和蛋白質(zhì)的濃度。平行3次取樣，得吸光度平均值。

由圖5可知，隨著NaCl濃度增加，Y變化不大，E先增大后減少，這是因?yàn)樵谳腿◇w系中加入NaCl，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，E上升，但是加入過多的NaCl，會促使萃取相的極性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶解度下降，E下降[16]，因此，NaCl最佳濃度為1%。

圖5 NaCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.5 pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響

選用濃度18%的PEG 4000和17%硫酸銨的雙水相體系，調(diào)節(jié)pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5，在每個分液漏斗中分別加入5.00 mL香菇水提液，搖勻，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，離心萃取30 min。

由于反季節(jié)農(nóng)產(chǎn)品價(jià)值高，大大刺激了農(nóng)戶對好肥料的需求，在這里最常聽到的一句話就是“只要肥料好，價(jià)錢多少都無所謂”。因此，幾百塊錢一包（袋）的進(jìn)口肥在當(dāng)?shù)胤浅充N。為讓廣大農(nóng)戶用到性價(jià)比更高的國產(chǎn)肥料，9月底第一批反季節(jié)瓜菜進(jìn)入栽種期時(shí)，新洋豐決定在東方市八所鎮(zhèn)小嶺村用洋豐百倍邦套餐施肥以茄子為示范作物挑戰(zhàn)在當(dāng)?shù)睾軙充N的進(jìn)口肥料。

Sarangi等[17]發(fā)現(xiàn)體系的pH與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻，pH的微小變化可能會使蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)改變較大，由圖6可知，隨著pH增加，Y變化不大，E先增大后減少。因此，最佳pH為6.5。

2.3 正交試驗(yàn)與結(jié)果分析

2.3.1 正交試驗(yàn)

圖6 pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以PEG 4000濃度（A）、硫酸銨的濃度（B）、氯化鈉濃度（C）及pH（D）為因素，采用L9(34)正交進(jìn)行試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)見表1，所得結(jié)果見表2。以蛋白質(zhì)萃取率為指標(biāo)，優(yōu)化萃取最佳工藝參數(shù)。由極差R分析可知，4個因素對蛋白質(zhì)萃取率影響的主次順序?yàn)?NH4)2SO4濃度（B）＞pH（D）＞PEG 4000濃度（A）＞NaCl濃度（C）。結(jié)合均值K分析得最佳工藝條件為A2B2C2D2，即PEG 4000濃度18%、(NH4)2SO4濃度17%、NaCl濃度1%、pH 6.5。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，按照正交試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件進(jìn)行提取，蛋白質(zhì)萃取率平均達(dá)81.57%，高于表2中所有試驗(yàn)組合的蛋白質(zhì)萃取率。

何良諸明白，站得太近，鐵鍬削下別人的腦袋，當(dāng)煤塊扔進(jìn)車?yán)?，就壞菜了。誰都看不見誰，腦袋沒了，身體站著，手里舉著鍬，別人尋思你還在于活呢。在死黑里，容易引起殘暴的聯(lián)想。三個人分開，從礦車兩側(cè)和車尾，三個不同的方向，將煤一鍬鍬扔進(jìn)車內(nèi)，噗通、噗通聲，分外沉悶。扔了幾十鍬后，年輕人直起身，喘。何良諸也喘起來，干體力活不行了。年輕人說：“難怪說礦工吃的是陽世飯，干的是陰間活?！?/p>

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)采用PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系對香菇柄水提液中的多糖與蛋白質(zhì)進(jìn)行分離萃取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出蛋白質(zhì)最佳萃取參數(shù)為：香菇柄水提液5.00 mL，PEG 4000濃度18%，硫酸銨濃度17%，NaCl濃度1%，pH 6.5，蛋白質(zhì)萃取率為81.57%。

多糖脫蛋白質(zhì)的方法除了雙水相萃取以外，還有Sevag法和三氯乙酸法。Sevag法是分離多糖中蛋白質(zhì)的常見方法，該法采用氯仿與戊醇或正丁醇的混合液反復(fù)處理多糖，效果較好，但消耗大量有機(jī)試劑，導(dǎo)致多糖產(chǎn)品成本上升，同時(shí)水相和有機(jī)相多次混合、分離，對多糖的產(chǎn)率有一定影響[18]。三氯乙酸法脫蛋白質(zhì)的效率較高，但需在低溫情況下進(jìn)行，且三氯乙酸具有較強(qiáng)的酸性，容易引起多糖糖苷鍵斷裂[19]。而雙水相體系萃取法簡單方便，萃取溫度接近室溫，不會引起蛋白質(zhì)失活或變性，化學(xué)試劑使用少，幾乎無污染，是一種綠色的萃取方法。