均勻設(shè)計法優(yōu)化麥麩阿魏酸的酶法提取工藝

趙文紅，馮麗然，關(guān)二旗，楊國龍*

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

麥麩是小麥生產(chǎn)副產(chǎn)品，在中國年產(chǎn)量超過2 000萬t[1]。麥麩的用途單一，較大一部分會被用作動物飼料[2]，這種用途技術(shù)含量特別低，造成資源的嚴重浪費；有時會被當(dāng)作釀造輔料進行食品的加工，附加值較低[3]，因此有必要對其進行進一步開發(fā)，以實現(xiàn)副產(chǎn)品資源的高效利用。

麥麩含有豐富的礦物元素[4]、膳食纖維[5]和酚酸等[6]天然活性成分。其中，阿魏酸（FA）是其含量最多的酚酸成分[7]（其分子結(jié)構(gòu)見圖1）。阿魏酸具有的天然獨特的抗氧化性、抑菌性和抗癌特性[8]，且被人體吸收后易從尿液中排出，不在體內(nèi)形成累積[9]，因此在醫(yī)藥、食品行業(yè)和化妝品行業(yè)中均有應(yīng)用[10]。試驗針對麥麩中的阿魏酸進行提取工藝優(yōu)化研究，可綜合利用小麥副產(chǎn)物，提高麥麩附加值，從而實現(xiàn)更大的經(jīng)濟和社會效益。

目前，采用堿解法、酶水解法、酶-堿協(xié)同提取法、高溫蒸煮法等[11]提取制備阿魏酸。其中，酶解法是利用生物活性酶水解植物細胞壁，從而使阿魏酸被分解出來。相比其他方法，酶法效果卓越，穩(wěn)定性強且安全清潔[12]，具有利用前景。試驗通過酶水解法來提取麥麩中阿魏酸。

在前期初步酶解反應(yīng)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)多種因素影響麥麩阿魏酸的提取，可通過均勻設(shè)計考察這些因素對酶解效果影響的大小及順序。均勻設(shè)計是一種適合在考察因素多、水平多的情況下用較少的試驗次數(shù)得到較優(yōu)工藝條件的試驗方法，可將各試驗因素按重要性排序，簡便靈活，并且所得結(jié)果精確可靠[13]。試驗采用均勻設(shè)計來優(yōu)化麥麩阿魏酸的提取工藝，從而得到最佳的酶解工藝條件。

在前期酶法提取麥麩阿魏酸基礎(chǔ)上，利用Viscozymel復(fù)合酶水解麥麩，進行單因素試驗和均勻設(shè)計優(yōu)化麥麩阿魏酸的酶法提取工藝試驗，并通過分光光度計和HPLC法進行提取物的定性鑒別，為小麥資源的綜合利用和和保健品開發(fā)提供試驗支撐。

圖1 阿魏酸的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

小麥麩皮（鄭州金苑面業(yè)有限公司）；α-淀粉酶、中性蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Viscozymel復(fù)合酶（Sigma Life Science公司）；生化試劑為生物純（BR）；無水乙醇、醋酸、醋酸鈉等均為分析純（AR）。

UV-6100S紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；BJ-300多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；101電熱鼓風(fēng)干燥器（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；AL204電子分析天平（梅特勒-托利多儀有限公司）；PHS-3C酸度計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理和酶活力測定

將新鮮麥麩在105 ℃下滅酶4 h，粉碎，按歐仕益等[8]的方法采用淀粉酶和蛋白酶脫除去麥麩中所含的淀粉和蛋白質(zhì)，將樣品烘干，粉碎，過80目備用。

在酶活力測定中，通過標準曲線法對Viscozymel復(fù)合酶進行酶活力測定[14]，所得Viscozymel復(fù)合酶酶活為98.67 U/mL。

1.2.2 麥麩阿魏酸含量測定

參考Katapodis等[15]使用的紫外雙波長法，取阿魏酸酶解液與100 mmol/L MOPS緩沖溶液（pH 6.0）按1∶2比例，分別在286和325 nm波長下測定溶液的吸光度。已知阿魏酸的摩爾吸光系數(shù)ε286=14 176 L·mol-1·cm-1，ε325=10 350 L·mol-1·cm-1，結(jié)合型阿魏酸的摩爾吸光系數(shù)ε’286=12 465 L·mol-1·cm-1，ε’325=19 345 L·mol-1·cm-1。根據(jù)朗伯比爾定律A=εbc可知物質(zhì)的濃度與吸光度呈正比。按照式（1）計算酶解產(chǎn)物中阿魏酸含量。

式中：C為阿魏酸濃度，mol/L；A286為被測液在286 nm處吸光度；A325為被測液在325 nm處的吸光度；b為比色皿厚度，cm。

1.3 酶法提取阿魏酸的單因素試驗

1.3.1 最適酶解時間的確定

準確稱取11份2 g麥麩膳食纖維，加入40 mL pH 5.0，質(zhì)量濃度為3 g/L的酶液，在50 ℃恒溫振蕩器中分別酶解1，2，4，6，8，10，12，18，24，30和36 h，酶解結(jié)束后于沸水浴中滅酶，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液測定阿魏酸濃度。

1.3.2 最適酶添加量的確定

準確稱取5份2 g麥麩膳食纖維，加入40 mL pH 5.0，質(zhì)量濃度1，2，3，4和5 g/L的酶液，在50 ℃恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后于沸水浴中滅酶，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液測定阿魏酸的濃度。

1.3.3 最適pH的確定

準確稱取6份2 g麥麩膳食纖維，分別加入40 mL pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0，質(zhì)量濃度為3 g/L的酶液，在50 ℃恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后于沸水浴中滅酶，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液測定阿魏酸濃度。

1.3.4 最適溫度的確定

準確稱取5份2 g麥麩膳食纖維，加入40 mL pH5.0，質(zhì)量濃度為3 g/L的酶液，分別在30，40，50，60和70 ℃恒溫振蕩器中酶解1 h，酶解結(jié)束后于沸水浴中滅酶，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液測定阿魏酸濃度。

1.3.5 最適底物濃度的確定

分別準確稱取1，2，3，4和5 g（25，50，75，100和125 g/L）膳食纖維，加入40 mL pH 5.0，質(zhì)量濃度為3 g/L的酶液，在50 ℃恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后于沸水浴中滅酶，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液測定阿魏酸的濃度。

1.4 均勻設(shè)計法優(yōu)化阿魏酸提取工藝條件設(shè)計

為了進一步優(yōu)化酶法提取麥麩阿魏酸的條件，在以酶解液中阿魏酸的濃度為指標研究5個單因素試驗基礎(chǔ)上，采用SPSS 19.0軟件中的Regression-Linear分析模型進行設(shè)置。選用均勻設(shè)計表U10(105)，均勻設(shè)計偏差D為0.241 4。選用對阿魏酸的提取量影響較大的5個因素——酶解時間（X1）、酶添加量（X2）、酶解pH（X3）、酶解溫度（X4）和底物濃度（X5）作為考察因素，設(shè)計各因素取值范圍見表1。以阿魏酸的提取量為指標，優(yōu)化酶法提取麥麩阿魏酸的最佳工藝條件，試驗設(shè)計方案見表2。

表1 均勻設(shè)計各因素取值表

表2 U10(105)均勻設(shè)計試驗方案

1.5 酶法提取麥麩阿魏酸的驗證試驗

按照1.4中數(shù)據(jù)分析得出的最佳提取工藝條件，進行3次重復(fù)試驗，對試驗結(jié)果進行驗證，觀察對麥麩阿魏酸提取量的影響。

1.6 酶解液中阿魏酸組分的定性鑒別

1.6.1 酶解液中阿魏酸組分的紫外光譜分析

參照孫元琳等[16]的研究，取適量阿魏酸樣品與100 mmol/L MOPS緩沖溶液（pH 6.0）按1∶2比例，進行紫外可見吸收掃描，掃描范圍為220～400 nm。

1.6.2 酶解液中阿魏酸組分的HPLC分析

精密稱取適量阿魏酸對照品，加入甲醇溶解標準品，作為對照品儲備溶液。參照曾鳳彩[17]的研究，取1 mL麥麩阿魏酸樣品（1 mg/mL）于試管中，加入1 mL NaOH溶液（0.4 mol/L）混勻后避光在35 ℃反應(yīng)3 h。取出冷卻后，加入1.5 mL H3PO4溶液（0.4 mol/L）中和。將反應(yīng)液和對照品溶液過0.45 μm有機濾頭后進行HPLC檢測。HPLC條件為：色譜柱ZORBAX SBC18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相為V（甲醇）∶V（1%醋酸溶液）=0.28∶0.72；流速1.0 mL/min；檢測波長320 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以x±SD表示，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件、SPSS 19.0軟件、Origin 8.0 繪圖軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法提取阿魏酸的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解時間對阿魏酸提取的影響

研究酶解時間對阿魏酸提取濃度的影響，選擇酶解時間1～36 h，在底物質(zhì)量濃度75 g/L、酶添加量3 g/L、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)溫度50 ℃條件下，酶解時間對阿魏酸濃度的影響如圖2所示。

結(jié)果表明，隨著酶解時間延長，所得阿魏酸濃度先增大后減小，酶解時間為4 h時，得到阿魏酸濃度最大，達到13.17×10-6mol/g。酶解4 h后，隨著酶解時間增長，阿魏酸濃度急劇減小，隨后趨于平緩。原因可能是酶在反應(yīng)過程中部分失活，產(chǎn)物的生成對酶促反應(yīng)有一定的抑制作用，以及隨著反應(yīng)的進行底物濃度逐漸降低等原因，造成酶解反應(yīng)速度下降。因此最佳酶解時間為4 h。

圖2 酶解時間對阿魏酸提取的影響

2.1.2 酶添加量對阿魏酸提取的影響

研究酶添加量對阿魏酸提取濃度的影響，選擇酶添加量范圍1～5 g/L，在反應(yīng)溫度50 ℃、底物質(zhì)量濃度75 g/L、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)時間4 h條件下，酶添加量對阿魏酸濃度的影響如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著酶添加量增加，阿魏酸濃度先增加后減小，酶添加量3 g/L時，得到的阿魏酸濃度最大，達到12.68×10-6mol/g。酶添加量3 g/L后，隨著酶添加量增加，阿魏酸濃度呈下降趨勢。

圖3 酶添加量對阿魏酸提取的影響

2.1.3 酶解pH對阿魏酸提取的影響

研究酶解pH對阿魏酸提取濃度的影響，選擇酶解pH 3.5～6.0，在反應(yīng)溫度50 ℃、底物質(zhì)量濃度75 g/L、酶添加量3 g/L、反應(yīng)時間4 h條件下，酶解pH對阿魏酸濃度的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著pH增大，阿魏酸濃度逐漸減小，從pH 3.5到pH 5.0變化趨勢較明顯，從pH 5.0到pH 6.0的變化緩慢，pH 3.5時，阿魏酸濃度達到最大值。因此最佳酶解pH 3.5。

圖4 酶解pH對阿魏酸提取的影響

2.1.4 酶解溫度對阿魏酸提取的影響

研究酶解溫度對阿魏酸提取濃度的影響，選擇酶解溫度范圍30～70 ℃，在底物質(zhì)量濃度75 g/L、酶添加量3 g/L、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)時間1 h條件下，酶解溫度對阿魏酸濃度的影響如圖5所示。

結(jié)果表明，在30～50 ℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度提高，阿魏酸濃度逐漸增大，溫度50 ℃時，阿魏酸濃度達到最大值，隨著溫度的繼續(xù)升高，阿魏酸濃度急劇下降。原因是酶的最適酶解溫度50 ℃，繼續(xù)增加溫度后，酶活力降低，酶解效果變差，因而阿魏酸濃度降低。因此最佳酶解溫度為50 ℃。

2.1.5 底物質(zhì)量濃度對阿魏酸提取的影響

研究底物質(zhì)量濃度對阿魏酸提取濃度的影響，選擇底物質(zhì)量濃度25～125 g/L，在反應(yīng)溫度50 ℃、酶添加量3 g/L、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)時間4 h條件下，底物濃度對阿魏酸濃度的影響如圖6。

結(jié)果表明，在試驗范圍內(nèi)，隨著底物濃度增加，阿魏酸濃度增加，底物質(zhì)量濃度25 g/L時，阿魏酸濃度為2.12×10-5mol/g，而底物質(zhì)量濃度125 g/L時，阿魏酸濃度降為1.49×10-5mol/g。原因是底物濃度增加時，降低了酶與底物的接觸幾率，酶反應(yīng)受到抑制，不利于酶解反應(yīng)進行，使得提取的阿魏酸含量降低。在后續(xù)優(yōu)化試驗中的中位底物質(zhì)量濃度選為75 g/L。

圖5 酶解溫度對阿魏酸提取的影響

圖6 底物質(zhì)量濃度對阿魏酸提取的影響

2.2 均勻設(shè)計法優(yōu)化阿魏酸的提取工藝結(jié)果

為進一步優(yōu)化酶解時間（X1）、酶添加量（X2）、酶解pH（X3）、酶解溫度（X4）和底物質(zhì)量濃度（X5）這5個對麥麩阿魏酸提取量影響較大的因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用U10(105)均勻設(shè)計方案，均勻設(shè)計試驗結(jié)果如表3所示。

如果采用直觀分析法，可以看出5號試驗所得到的阿魏酸的提取量最高為3.76×10-5mol/g，相應(yīng)的提取條件為：酶解時間5 h、酶添加量4 g/L、酶解pH 7.5、酶解溫度40 ℃、底物濃度25 g/L。利用SPSS 19.0軟件對試驗結(jié)果運用后退法進行多元回歸分析，取顯著性水平a=0.05，建立回歸方程：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b5X5。回歸系數(shù)：b0=2.23×10-4，b1=-0.99×10-5，b2=1.07×10-5，b3=1.80×10-5，b4=-0.02×10-5，b5=-0.09×10-5。偏回歸系數(shù)為：B1=-1.29，B2=1.39，B3=1.17，B4=-0.15，B5=-2.99。

標準化偏回歸系數(shù)的大小順序為：B5＞B2＞B1＞B3＞B4。可見酶解提取阿魏酸的均勻設(shè)計試驗中5個因素對提取的影響順序為：底物濃度＞酶添加量＞酶解時間＞酶解pH＞酶解溫度。通過回歸方程中酶的添加量系數(shù)為正數(shù)，可知該因素對試驗結(jié)果產(chǎn)生正向的影響。同時對阿魏酸的均勻設(shè)計顯著性檢驗及殘差分析，如表4。

由回歸分析結(jié)果和表4的變量分析表可知，樣本容量n=10，試驗建立的回歸方程為Y=2.23×10-4-0.99×10-5X1+1.07×10-5X2+1.80×10-5X3-0.02×10-5X4-0.09×10-5X5。檢驗值Ft=2.65，臨界值F(5,4)(0.05)=0.18，F(xiàn)t＞F(5,4)（0.05），回歸方程顯著，證明所建立模型有效。通過軟件尋優(yōu)計算得出最佳工藝指標參數(shù)，其中回歸方程Y預(yù)期最大值為3.59×10-5mol/g，此時X1=5，X2=4，X3=7.5，X4=40，X5=25，即酶解時間5 h、酶添加量4 g/L、酶解pH 7.5、酶解溫度55 ℃、底物質(zhì)量濃度25 g/L，在此工藝參數(shù)下所得的阿魏酸提取量可達3.64×10-5mol/g。

表3 U10(105)均勻設(shè)計試驗結(jié)果

表4 變量分析表

2.3 酶解提取阿魏酸的驗證試驗

根據(jù)均勻設(shè)計優(yōu)化得出工藝參數(shù)，即酶解時間5 h、酶添加量4 g/L、酶解pH 7.5、酶解溫度55 ℃、底物質(zhì)量濃度25 g/L，以及試驗最佳工藝參數(shù)（酶解時間5 h、酶添加量4 g/L、酶解pH 7.5、酶解溫度40 ℃，底物濃度25 g/L）條件下進行驗證試驗，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，優(yōu)化工藝條件下得到麥麩阿魏酸的平均提取量為（3.64±0.07）×10-5mol/g，優(yōu)于試驗最佳工藝條件下麥麩阿魏酸的提取量（3.46±0.073 32）×10-5mol/g。優(yōu)化工藝條件重復(fù)試驗RSD為1.95%，由此表明此工藝參數(shù)基本可靠，且重現(xiàn)性好。

2.4 酶解液中阿魏酸組分的定性鑒別

2.4.1 阿魏酸組分的紫外光譜分析

將提取的麥麩阿魏酸的紫外全波長掃描如圖7所示，從阿魏酸的紫外全波長掃描圖譜中可以看出，在325 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰。這與Jankovska等[18]研究中在325 nm左右這個位置出現(xiàn)較強的吸收特征峰表明是酚酸分子中苯環(huán)的特征吸收一致，表明酶解液組分中含有阿魏酸。

表5 酶解提取阿魏酸的工藝驗證

圖7 Sephadex LH-20凝膠柱洗脫組分的紫外全波長掃描圖譜

2.4.2 阿魏酸組分的HPLC分析

采用HPLC檢測對照品和提取的樣品中阿魏酸的成分，結(jié)果見圖8。

圖8 反式阿魏酸對照品（A）和麥麩樣品（B）HPLC圖譜

結(jié)果表明，反式阿魏酸HPLC的出峰時間為16.362 min，其中圖譜在19.066 min還出現(xiàn)一個很小的峰，此峰為順式阿魏酸的特征峰[19]。與FA標品相比，提取的麥麩阿魏酸樣品在16.362和19.066 min左右均出現(xiàn)檢出峰（圖B），說明酶解液成分中存在順、反式阿魏酸，并且順式與反式峰面積比例都在1∶10左右，這與丁明玉等[20]通過高效液相色譜法確認阿魏酸在川芎和當(dāng)歸藥材中的存在形式研究一致。

3 結(jié)論與展望

試驗采用Viscozymel復(fù)合酶水解麥麩，以阿魏酸的提取量為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用均勻設(shè)計法優(yōu)化影響提取阿魏酸的酶法的最佳工藝條件，并經(jīng)分光光度計和HPLC法進行定性鑒別。

1) 采用均勻設(shè)計法。對提取阿魏酸的均勻設(shè)計顯著性檢驗分析結(jié)果可得，檢驗值Ft=2.65，臨界值F(5,4)(0.05)=0.18，F(xiàn)t＞F(5,4)(0.05)，回歸方程顯著，證明所建立模型有效。據(jù)報道顯示，正交試驗法具有均勻分散、齊整可比的特點，但是當(dāng)試驗的因素和水平數(shù)都較多時，正交設(shè)計不具備可行性，而采用均勻設(shè)計可大大減少試驗的工作量，在很大程度上節(jié)約人力和物力；響應(yīng)面設(shè)計能夠得到幾種變量因素間的交互作用，但是對自變量有特殊要求，而均勻設(shè)計法具有更加方便和迅速的優(yōu)勢，并能將各試驗因素按重要性排序。

2) 酶法提取麥麩阿魏酸的均勻設(shè)計試驗中5個因素對提取的影響順序為：底物濃度＞酶添加量＞酶解時間＞酶解pH＞酶解溫度。獲得的最佳工藝為：酶解時間5 h、酶添加量4 g/L、酶解pH 7.5、酶解溫度55℃、底物質(zhì)量濃度25 g/L。此時麥麩阿魏酸提取量為3.64×10-5mol/g。對試驗得到的優(yōu)化條件進行驗證試驗可知，優(yōu)化工藝條件重復(fù)試驗RSD為1.95%，均勻設(shè)計優(yōu)化結(jié)果與試驗最佳工藝結(jié)果基本吻合。

3) 經(jīng)過分光光度計和HPLC法進行定性鑒別。麥麩酶解液的紫外光譜可見在325 nm存在較強的吸收峰，此結(jié)果顯示其具酚酸特征結(jié)構(gòu)；HPLC圖譜顯示其在16.362和19.066 min左右出現(xiàn)面積比例1∶10的檢出峰，與標準品對照可知提取物為順式阿魏酸和反式阿魏酸物。

近年來，阿魏酸的生理活性功能不斷被研究證實，從麥麩中提取阿魏酸的工藝也具有重要的現(xiàn)實意義。在后續(xù)研究中，可通過優(yōu)化食品原料中阿魏酸的提取工藝，利用阿魏酸及阿魏酸衍生物的抗氧化活性，將其應(yīng)用在保健品、食品、化妝品行業(yè)中，為實現(xiàn)副產(chǎn)品資源的高效利用提供理論依據(jù)與參考。