仙人掌超氧化物歧化酶提取、部分純化及其飲料的制備

閔玉濤，宋彥顯，聶卉，馬慶一

1. 鄭州工程技術(shù)學(xué)院（鄭州 450044）；2. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院（鄭州 450002）

米邦塔仙人掌（Opuntia Milpa Alta）原產(chǎn)于墨西哥，1997年由農(nóng)業(yè)部成功引入我國(guó)，20余年來(lái)在我國(guó)種植廣泛，已成為消費(fèi)者喜愛(ài)的蔬菜。米邦塔仙人掌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]。仙人掌中SOD、黃酮、果膠、多糖和纖維素等功能成分含量較多[3-5]，故具有降血糖，減肥、抗衰老、抗氧化、抗癌、保護(hù)細(xì)胞受損、降血脂等功效[6-9]。同時(shí)，仙人掌味道鮮美、口感清新、風(fēng)味獨(dú)特，是制作保健飲料的上佳原料之一。

以仙人掌為原料，以藍(lán)莓、靈芝、西瓜、獼猴桃等作為復(fù)配原料，開(kāi)發(fā)出的復(fù)合飲料和發(fā)酵乳制品報(bào)道較多[10-14]。仙人掌SOD含量是動(dòng)物血液的2倍，且安全性高，但仙人掌SOD保健飲料還鮮有報(bào)道。利用仙人掌中豐富的SOD開(kāi)發(fā)具有抗炎、抗衰老、抗氧化等功能的保健飲料，具有重要的研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

試驗(yàn)以仙人掌為原料，提取和部分純化SOD，以黃瓜作為復(fù)配材料制備仙人掌SOD功能飲料，為仙人掌資源的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米邦塔仙人掌（周口扶溝種植園）；黃瓜（毛莊菜市場(chǎng)）；蔗糖（食用級(jí)，西糖業(yè)有限公司）；乙酸鋅（食用級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙基麥芽酚（食用級(jí)，青島花帝食品配料有限公司）；Sephadex（G-75，Amersham Pharmacia）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；聯(lián)苯三酚（分析純，貴州遵義市建強(qiáng)化工有限公司）；聚乙二醇（分析純，派尼市化學(xué)試劑廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎勻漿機(jī)（JJ-2，金壇市億通電子有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（GL-22M，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；酸度計(jì)（HI253臺(tái)式，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；自動(dòng)部分收集器（BSZ-100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌SOD的提取

稱200 g仙人掌用蒸餾水洗凈，切成3 cm×2 cm的塊，加入18 mL pH 7.8 0.05 mol/L的磷酸緩沖液。勻漿、過(guò)濾，濾液在4 ℃下，以8 000 r/min離心10 min。收集上清液460 mL，加入960 mL冷丙酮，放入4 ℃冰箱中過(guò)夜。收集沉淀，加入95 mL磷酸緩沖液溶解，總體積108 mL。離心除去不溶物質(zhì)，收集上清液100 mL。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[15]采用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 酶活力的測(cè)定

在pH 8.2、25 ℃條件下，1 mL的反應(yīng)液中1 min聯(lián)苯三酚在325 nm波長(zhǎng)處的自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為1個(gè)活力單位。按照文獻(xiàn)[16]采用聯(lián)苯三酚自氧化法測(cè)定和計(jì)算酶活力。

1.3.4 硫酸銨鹽溶、鹽析

收集的上清液中加入9.54 g固體硫酸銨至飽和度20%，4 ℃冰箱中放置2～3 h。高速離心機(jī)離心10 min、10 000 r/min，收集上清液80 mL。再測(cè)蛋白質(zhì)濃度、酶活。添加固體硫酸銨37.52 g至飽和度90%。放入4℃冰箱過(guò)夜。以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心40 min，收集沉淀。加入8 mL磷酸緩沖液溶解即為酶液。測(cè)蛋白質(zhì)濃度、酶活。

1.3.5 透析、反滲透

將酶液移入處理好的透析袋中，在磷酸緩沖液中，4 ℃下透析過(guò)夜，不時(shí)攪拌。將透析完畢的透析袋，用聚乙二醇覆蓋脫水，待袋內(nèi)溶液體積濃縮到10 mL左右，取出即為濃縮酶液。

1.3.6 Sephadex G-75凝膠層析純化

凝膠經(jīng)預(yù)處理，裝柱，平衡，將10 mL濃縮酶液一次性裝入事先處理好的Sephadex G-75柱。用磷酸緩沖液洗脫，用自動(dòng)收集器收集，調(diào)整流速，每10 min自動(dòng)收集一管，每管約5～6 mL。每隔3管測(cè)1次酶活，將有酶活的溶液試管合并，再用聚乙二醇反滲透。所得溶液即為部分純化的SOD酶液。

1.3.7 仙人掌SOD功能飲料的制備及檢測(cè)

仙人掌SOD功能飲料的制備工藝流程：

1.3.7.1 原材料的選擇與清洗除雜

選擇無(wú)病斑、無(wú)蟲(chóng)害、新鮮、綠色、肉質(zhì)肥厚的仙人掌片和無(wú)病蟲(chóng)害、鮮嫩的黃瓜，清洗除去雜質(zhì)。

1.3.7.2 切片

仙人掌除刺，去掉仙人掌的表面硬皮后，將其切成30 cm×10 cm薄片。黃瓜去皮后切除兩端掛蒂，切成3～5 cm厚的塊狀。

1.3.7.3 熱燙護(hù)色

黃瓜90 ℃熱燙3～5 min，投入0.04%的醋酸鋅護(hù)色液，浸泡15 min。

1.3.7.4 原料取汁

經(jīng)熱燙護(hù)色的黃瓜迅速用水冷卻，并將燙漂液沖洗干凈，以1∶1.5（g/mL）加水打漿，制得漿液備用。仙人掌以1∶1.5（g/mL）加水打漿，制得漿液備用。

1.3.7.5 澄清

制得的仙人掌漿液、黃瓜漿液用4層紗布過(guò)濾，濾出液置入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30～60 min，4 ℃環(huán)境下靜置3～4 h。濾出上清液，棄去沉淀。

1.3.7.6 調(diào)配

將稱量好的蔗糖、乙基麥芽酚加入黃瓜汁中，加入檸檬酸調(diào)pH 4.0。飲料配方：黃瓜汁100 mL、仙人掌汁100 mL、蔗糖10 g（5%）、檸檬酸0.15 g（0.000 8%）、乙基麥芽酚0.03 g（0.002%）。

1.3.7.7 殺菌

調(diào)配好的黃瓜汁裝瓶后采用90 ℃，30 min殺菌，冷卻至室溫。將微波30 s滅菌處理過(guò)的仙人掌汁裝入事先殺菌過(guò)的黃瓜汁中。

1.3.7.8 測(cè)酶活力

按照1.3.3測(cè)定飲料中SOD酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙人掌SOD的提取純化結(jié)果

仙人掌經(jīng)鹽溶、鹽析、透析和Sephadex G-75層析純化后，酶活力、活力回收率、提純倍數(shù)如表1所示。

由表1可知，經(jīng)提取和部分純化后酶活力的回收率為19.23%，純化倍數(shù)9.13。隨著純化步驟的進(jìn)行，蛋白質(zhì)和酶活力總量逐漸減少，但SOD比活力逐漸提高。仙人掌SOD粗酶總活力13 760 U，含量豐富，可以仙人掌為原料制備SOD功能飲料。

2.2 Sephadex G-75洗脫曲線

從圖1中可看出，酶活力隨著洗脫體積增加而增高，在緩沖液洗脫體積在80 mL左右，酶活力達(dá)到最高。洗脫過(guò)程是大分子量組分先被洗脫，小分子量的組分后被洗脫。SOD在50 mL以后逐漸被洗脫出。葡聚糖凝膠（Sephadex）內(nèi)部具有網(wǎng)狀篩孔。Sephadex G-75凝膠可區(qū)分分子量在3 000～70 000 Da之間的分子，SOD分子量在32 000～40 000 Da，可以進(jìn)入Sephadex G-75的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流出時(shí)間的長(zhǎng)短居中，如圖1中尖峰的位置所示（對(duì)應(yīng)于約83 mL洗脫體積）。

2.3 復(fù)合原料的選擇結(jié)果

在選擇復(fù)合原材料時(shí)考慮到飲料的色澤和風(fēng)味等方面的因素，采用與仙人掌相接近的黃瓜作為飲料的另一種原材料。黃瓜本身的抗褐變能力強(qiáng)，并且在掩蓋仙人掌青澀味方面也起到了一定效果。

表1 酶活力、比活力、活力回收率、提純倍數(shù)的測(cè)定表

圖1 仙人掌SOD Sephadex G-75洗脫曲線

2.4 熱燙護(hù)色結(jié)果

在果蔬組織內(nèi)含有多種酚類物質(zhì)和多酚氧化酶，在加工過(guò)程中，由于組織破壞與空氣接觸，使酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化，生成褐色的醌類物質(zhì)，從而影響外觀，也破壞了風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這種褐變主要來(lái)源于酶促褐變，其關(guān)鍵作用的因子有酚類底物、酶和氧氣。為保留飲料中SOD酶活力，仙人掌不做漂燙護(hù)色處理。黃瓜進(jìn)行漂燙和護(hù)色處理能夠鈍化酶，軟化組織，阻止葉綠素褪色和褐變，并提高出汁率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃瓜采用90 ℃熱燙3～5 min，投入0.04%的醋酸鋅溶液（pH 8.0）中護(hù)色15 min，效果最佳。

2.5 澄清結(jié)果

采取的澄清法是將制備好的黃瓜汁、仙人掌汁分別用磁力攪拌器攪拌30和60 min（仙人掌汁含的果膠多，攪拌時(shí)間長(zhǎng)，能充分破壞膠體結(jié)構(gòu)，使沉淀物快速地沉淀下來(lái)），移入4 ℃冰箱中自然澄清3～4 h，取出濾除沉淀。此法結(jié)合自然澄清和冷凍澄清完成。利用此方法制成的飲料證明澄清效果比較滿意，飲料放置一段時(shí)間后并無(wú)沉淀出現(xiàn)。

2.6 滅菌結(jié)果

仙人掌SOD保健飲料，如用熱殺菌進(jìn)行滅菌，將會(huì)導(dǎo)致仙人掌SOD酶活性喪失，所以不能采取傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)，需要采用冷殺菌工藝。生物體作為極性介質(zhì)吸收微波能量后使生物體的蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性凝固，從而達(dá)到殺菌目的，且對(duì)試驗(yàn)條件要求低，可以作為仙人掌SOD保健飲料的殺菌方法。

2.7 飲料風(fēng)味和SOD含量

飲料中所添加的乙基麥芽酚和果糖，前者對(duì)苦澀有消殺作用，對(duì)特有風(fēng)味有“乳化作用”，具有抗菌，防腐性能；能有效延長(zhǎng)食品儲(chǔ)存期；后者使風(fēng)味將更醇厚，有利于糖尿病患者和肥胖患者食用。制備的飲料口感細(xì)膩，具有仙人掌和黃瓜獨(dú)特的清香味；色澤青綠，無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀，其具有的SOD酶活力為2 U/mL。

3 結(jié)論

米邦塔食用仙人掌經(jīng)勻漿、硫酸銨鹽溶、鹽析、Sephadex G-75凝膠層析等方法提取純化SOD，提取粗酶活力137.60 U/mL，經(jīng)提取純化后SOD比活力413.68 U/mL，純化倍數(shù)和活力回收率分別為9.25和19.13%。仙人掌和黃瓜經(jīng)清洗除雜、切片、熱燙護(hù)色、榨汁、澄清、調(diào)配和殺菌等工藝，制備仙人掌SOD保健飲料，飲料口感細(xì)膩，具有仙人掌和黃瓜獨(dú)特的清香味；色澤青綠，無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀，SOD酶活力為2 U/mL，可為仙人掌的深加工技術(shù)提供參考，提高仙人掌的附加值。