乳酸菌粉培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配研究及應(yīng)用

李鵬沖，張立攀*，章建軍，趙夢(mèng)瑤，劉兵戈，董建民

河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司（鄭州 450002）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指發(fā)酵糖類(lèi)主要產(chǎn)物為乳酸的一類(lèi)無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)[1]。乳酸菌是具有多重生理功能的微生物菌群，能夠促進(jìn)人體內(nèi)乳酸酶的產(chǎn)生，使乳糖不耐癥患者的發(fā)病率得到明顯的降低[2]。乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)物賦予食品不同風(fēng)味，另難以被人體消化吸收的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解，微量元素含量得到增加，提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和人體的吸收利用率[1]。乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的生物菌群，改善腸道功能且發(fā)酵后過(guò)氧化氫等抗性物質(zhì)夠抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，可延緩產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[3]。乳酸菌因?qū)θ藗兊纳眢w健康有著不可忽視作用，使其受到社會(huì)各界廣泛關(guān)注的目光，在食品行業(yè)中，中國(guó)的發(fā)酵乳制品占益生菌制品總量的1/2以上，并且每年的增長(zhǎng)速度相當(dāng)可觀[4]。2015年果蔬發(fā)酵提出，便受關(guān)注，其主要是將多種乳酸菌種按照比例接到果蔬汁中。共同作用使果蔬汁發(fā)生復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)，飲料各項(xiàng)品質(zhì)得到提高。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究出將有益微生物制成含有活菌菌體和代謝產(chǎn)物的益生菌制劑[5]。益生菌的應(yīng)用更加趨向于多樣化，必將成為未來(lái)發(fā)展的流行趨勢(shì)。

傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵劑制法不僅過(guò)程復(fù)雜繁瑣，而且效果并不理想[6]。為此，企業(yè)迫切需要一種操作簡(jiǎn)單、含菌量高、直投式發(fā)酵劑。目前我國(guó)乳酸菌發(fā)酵劑操作系統(tǒng)不夠完善，很多大中型企業(yè)生產(chǎn)所需要的發(fā)酵劑都通過(guò)國(guó)外獲得。直投式乳酸菌粉具有活力高、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵劑的特點(diǎn)，能夠打破傳統(tǒng)企業(yè)生產(chǎn)的局限，生產(chǎn)量得到大幅度提高[7]。因此研發(fā)一種適合我國(guó)企業(yè)生產(chǎn)的直投式發(fā)酵劑成為當(dāng)前首要任務(wù)。

為了培育符合要求的乳酸菌粉，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)培育乳酸菌的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)素成分的比例進(jìn)行調(diào)整以達(dá)到目的。目前很多知名專(zhuān)家都對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基方面展開(kāi)了研究，并且取得了相當(dāng)不錯(cuò)的成績(jī)。例如房興利等[8]通過(guò)對(duì)MRS培養(yǎng)基、葡萄糖酵母培養(yǎng)基進(jìn)行改良；劉宇峰等[9]用含有胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl、L-半胱氨酸的復(fù)合培養(yǎng)和天然脫脂乳培養(yǎng)基分別培養(yǎng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌得出脫脂乳優(yōu)于復(fù)合培養(yǎng)基；姜曄[10]以胡蘿卜汁作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑。對(duì)于乳酸菌劑的保存，常壓干燥法具有效果理想、成本較低的優(yōu)勢(shì)，很適合企業(yè)生產(chǎn)使用。研究的目標(biāo)對(duì)乳酸菌粉載體和培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化，通過(guò)常壓干燥的方法獲得乳酸菌菌粉，為發(fā)酵果蔬提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料

菌種：植物乳酸菌、嗜酸乳酸菌為河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

培養(yǎng)基：（1）種子液培養(yǎng)基為MRS肉汁種子培養(yǎng)基。載體培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)DD培養(yǎng)基）山楂：山東沂蒙山楂優(yōu)果。

1.2 主要試劑

MRS牛肉膏粉末為生化級(jí)試劑，葡萄糖均為分析純?cè)噭?，?環(huán)糊精、麥芽糊精、抗性糊精、大豆蛋白、菊粉均為食品級(jí)添加劑。

果膠酶（食品級(jí)，酶活力10 000 U/g）上海生物科技有限公司；無(wú)水乙醇（C2H6O）；硫酸（H2SO4優(yōu)級(jí)純）；氫氧化鈉（40 g/L）等均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

JY2002電子天平，上海橫平儀器表廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LH-250R生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；N2S可見(jiàn)分光光度測(cè)定儀，上海儀電分析儀器有限公司；離心機(jī)L550，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；電磁爐JYC-21，九陽(yáng)股份有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 制備乳酸菌劑試驗(yàn)過(guò)程

將活化后的試管斜面保存菌種嗜酸乳酸菌和植物乳酸菌分別接種于含MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)24 h左右，然后接種于DD培養(yǎng)基中，混合均勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱24 h培養(yǎng)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源的添加量對(duì)菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中蛋白粉和水分的量，對(duì)葡萄糖進(jìn)行調(diào)控。分別向DD培養(yǎng)基中添加2%，3%，4%，5%，6%和7%的葡萄糖。待所有成分都加完后混合攪拌均勻，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測(cè)其吸光度，確定最佳碳源量范圍。

2.2.2 氮源的添加量對(duì)菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中葡萄糖和水的量，對(duì)蛋白粉進(jìn)行調(diào)控。分別向載體中添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的蛋白粉，待所有成分都加完后混合攪拌均勻，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。確定最佳氮源量范圍。

2.2.3 水分的添加量對(duì)菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白粉的量，對(duì)加水量進(jìn)行調(diào)控。分別向載體中添加5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%的水量，待所有成分都加完后混合攪拌均勻，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。確定最佳加水量范圍。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以乳酸菌的吸光度為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)葡萄糖（A）、蛋白粉（B）和水分添加量（C）3個(gè)因素進(jìn)行考察，其中每個(gè)因素均有3個(gè)水平，見(jiàn)表1。

表1 DD培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.4 檢測(cè)方法

接入菌種的載體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌密度測(cè)定。菌量測(cè)定采用比濁法：1 g樣品采用梯度稀釋法稀釋到100倍，從稀釋100倍的樣液中取一部分倒入比色皿中，以生理鹽水作為參照，在600 nm波長(zhǎng)處用可見(jiàn)分光光度儀對(duì)吸光度（A）進(jìn)行測(cè)定。吸光度與菌落總數(shù)成正比。記錄數(shù)據(jù)。

2.5 乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料的制備

2.5.1 工藝流程

山楂果挑揀→去核（稱(chēng)量）→清洗→加水煮制（100 ℃，10 min）→打漿→冷卻→酶解（單寧酶、果膠酶）→滅酶→滅菌→發(fā)酵（乳酸菌劑）→成品

2.5.2 基礎(chǔ)工藝條件

1) 參考張志軍[11]的方法，用果膠酶對(duì)山楂汁進(jìn)行處其工藝?yán)砺宰髡{(diào)整：即酶解溫度48 ℃，酶添加量為0.9%，酶解時(shí)間為4 h測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。出汁率測(cè)定：參考任曼妮[12]的方法。含酸量測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB 5009.157—2016。還原糖測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006。

式中：W1為測(cè)得的單寧含量；C為由工作曲線查出的鞣酸質(zhì)量濃度，μg/mL；m為稱(chēng)取的樣品質(zhì)量，g；V為樣品溶液的體積，mL。

3) 參考李剛等[17]發(fā)酵山楂汁工藝略作修改：取酶處理并滅酶滅菌的山楂汁，接種量4%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間18 h、混合糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%（蔗糖與葡萄糖質(zhì)量比3∶2），進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵。

2.6 感官評(píng)價(jià)

對(duì)發(fā)酵山楂飲料的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行感官評(píng)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌粉工藝優(yōu)化分析

3.1.1 葡萄糖添加量對(duì)乳酸菌吸光度的影響

圖1顯示，隨著葡萄糖的添加量的逐步增加，乳酸菌粉的吸光度呈上升趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖的添加量為6%時(shí)，菌粉的吸光度增長(zhǎng)速度最快，當(dāng)葡萄糖添加量繼續(xù)上升時(shí)，菌粉的吸光度增長(zhǎng)速度減緩，故試驗(yàn)中選擇葡萄糖的添加量為6%左右。

圖1 不同比例的葡萄糖添加量對(duì)乳酸菌吸光度的影響

3.1.2 蛋白粉添加量對(duì)乳酸菌吸光度的影響

圖2顯示，當(dāng)?shù)鞍追鄣暮恐鸩皆黾訒r(shí)，菌粉的吸光度整體呈上升趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖的添加量為2.5%時(shí)，菌粉的吸光度增長(zhǎng)速度最快，當(dāng)?shù)鞍追厶砑恿坷^續(xù)上升時(shí)，菌粉的吸光度增長(zhǎng)速度減緩，故試驗(yàn)中選擇蛋白粉的添加量為2.5%左右適宜。

(1)激光雷達(dá)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，主要指激光雷達(dá)系統(tǒng)中的硬件部分。創(chuàng)新和發(fā)展激光光源技術(shù)、發(fā)射和接收技術(shù)、信號(hào)采集和處理技術(shù)是提高大氣環(huán)境監(jiān)測(cè)精度的最直接方法。

3.1.3 加水量對(duì)乳酸菌吸光度的影響

圖3顯示了不同比例的水分含量對(duì)乳酸菌吸光度的影響結(jié)果。當(dāng)水分含量逐步增加時(shí)，菌粉的吸光度在剛開(kāi)始呈上升趨勢(shì)，隨著水分含量增加，乳酸菌吸光度反而下降。當(dāng)葡萄糖的添加量為15.5%時(shí)，菌粉的吸光度增長(zhǎng)速度最快，故試驗(yàn)中選擇加水量為15.5%左右。

圖2 添加不同比例的蛋白粉對(duì)乳酸菌吸光度的影響

圖3 添加不同比例的水分對(duì)乳酸菌吸光度的影響

3.1.4 葡萄糖、蛋白粉及加水量對(duì)乳酸菌吸光度的影響

為了進(jìn)一步了解葡萄糖、蛋白粉及加水量對(duì)乳酸菌吸光度的綜合影響，試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了正交優(yōu)化（表2），根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)共得出9組試驗(yàn)結(jié)果（表3），其試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)得到的平均值。結(jié)果見(jiàn)表3。

試驗(yàn)所制乳酸菌粉呈細(xì)小固體顆粒狀，質(zhì)感較為蓬松干燥，顏色呈米黃色，具有乳酸菌發(fā)酵氣味。根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，由表2可得出，葡萄糖添加量（A）、蛋白粉添加量（B）和水分添加量（C）對(duì)菌粉中乳酸菌數(shù)量的影響順序?yàn)椋篊＞A＞B。最佳組合為A3B1C3。在24 h培養(yǎng)前對(duì)乳酸菌粉進(jìn)行檢測(cè)，得出菌粉吸光度3次平均值為0.012，24 h培養(yǎng)后最佳菌粉組合吸光度3次平均值為0.049，增長(zhǎng)量達(dá)到75%以上。即葡萄糖添加量為6%，蛋白粉添加量為2.5%，加水量為15.5%時(shí)，此時(shí)的菌粉中的乳酸菌含量最高，增長(zhǎng)率高達(dá)408.3%，增菌效果顯著。

3.2 乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料的分析

3.2.1 山楂汁酶處理的分析

3.2.1.1 果膠酶處理分析

通過(guò)表4可以看出，山楂汁在此工藝下出汁率達(dá)到54.0%，含酸量達(dá)到1.63%，還原糖含量達(dá)到4.13%。

3.2.1.2 單寧酶處理分析

據(jù)式（1）計(jì)算出單寧含量的0.31%，山楂單寧含量的降低可以改善其對(duì)山楂飲料品質(zhì)與口感的影響[18]。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 DD培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 酶處理后指標(biāo)檢測(cè)

3.2.2 感官評(píng)價(jià)分析

參考葡萄酒的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料進(jìn)行評(píng)價(jià)如表5所示。

通過(guò)表5可看出，經(jīng)過(guò)六人小組評(píng)價(jià)得分在66～72分之間變動(dòng)，具有乳酸發(fā)酵的獨(dú)特風(fēng)味，說(shuō)明此山楂發(fā)酵飲料結(jié)果的可行性[19]。相比傳統(tǒng)的發(fā)酵，縮短工藝，產(chǎn)生效益。

表5 山楂飲料感官評(píng)價(jià)

4 結(jié)論

1) 試驗(yàn)通對(duì)果蔬發(fā)酵乳酸菌粉培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化復(fù)配研究，得出結(jié)論，葡萄糖的添加量為6%，蛋白粉的添加量為2.5%，水的添加量為15.5%時(shí)，此時(shí)菌粉中的乳酸菌含量最高，增長(zhǎng)量達(dá)到75%以上，增菌效果顯著。

2) 通過(guò)對(duì)山楂汁進(jìn)行酶處理，使得山楂汁中的出汁率了達(dá)到54.0%，含酸量為1.63%，還原糖含量為4.13%。并使得單寧的含量降低到了0.31%，改善了發(fā)酵山楂飲料的口味與品質(zhì)。

3) 利用乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料口味獨(dú)特，相比傳統(tǒng)發(fā)酵極大縮短時(shí)間。

通過(guò)發(fā)酵菌劑發(fā)酵提高了企業(yè)的生產(chǎn)效率，使企業(yè)產(chǎn)量得到增加。后期可以再對(duì)乳酸菌粉進(jìn)行干燥處理，制得水分含量低的菌粉，在方便保藏的同時(shí)，有效地防止了菌種的污染和老化，打破了企業(yè)生產(chǎn)的局限性，適合企業(yè)的生產(chǎn)使用。