響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖大黃素的提取工藝

董加寶 ，彭心潔，賀思

1. 湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（永州 425199）；2. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院（永州 425199）

虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物的根莖，是我國(guó)一種傳統(tǒng)中藥，大量分布于西北、華東、華中、華南及西南等地，具有悠久的藥用歷史。虎杖中除白藜蘆醇外最重要的活性成分是虎杖大黃素，大黃素可通過(guò)抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子來(lái)阻斷肝星狀細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗纖維化作用[1-2]。大黃素還對(duì)肝纖維化肺損傷具有一定的保護(hù)作用[3]，增加巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬能力，減輕炎癥反應(yīng)[4]、保護(hù)心肌細(xì)胞、減輕心肌炎癥[5-6]。研究表明，大黃素對(duì)非酒精性脂肪肝有治療作用[7-9]，可預(yù)防膽固醇結(jié)石的形成[10]、抑制金黃色葡萄球菌[11-12]、抗腫瘤[13]，在食品工業(yè)上可以起到抗氧化、抑制食品糖基化產(chǎn)物形成的作用[14]。

目前，從虎杖花及果實(shí)中提取大黃素主要方法有雙水相萃取[15]、正交試驗(yàn)提取[16]、超聲輔助提取[17-18]。試驗(yàn)以虎杖根為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖中大黃素的提取工藝條件，以期為優(yōu)化虎杖大黃素的提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（成都克洛瑪生物科技有限公司）；虎杖根（采自永州市零陵區(qū)西山，放置于80 ℃烘箱中烘干，經(jīng)粉碎后過(guò)100 目篩得虎杖粗粉，避光保存?zhèn)溆茫患状迹ǚ治黾?，?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、乙醚（均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津有限公司）；JA1003N電子天平（上海菁海儀器有限公司）；FW177粉碎機(jī)（湖南東晟電子有限公司）；DZF-6050真空干燥箱、SHB數(shù)顯三用恒溫水箱（鞏義市英谷高科儀器廠）。

1.3 虎杖根大黃素提取單因素試驗(yàn)

不同溶劑對(duì)大黃素的提取效果：稱取5份0.5 g的虎杖粗粉，倒入試管中，在30 ℃下分別取用10 mL的95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水、乙醚振蕩浸提30 min，取浸提液過(guò)濾，測(cè)定提取率。

不同溶劑濃度對(duì)大黃素的提取效果：配置體積分?jǐn)?shù)為65%，70%，75%，80%和85%的乙醇溶劑，分別振蕩浸提30 min后，取浸提液過(guò)濾，測(cè)定提取率。

不同溫度對(duì)大黃素的提取效果：分別在20，30，40，50和60 ℃的溫度下，加入75%乙醇，振蕩浸提30 min后，取浸提液過(guò)濾，測(cè)定提取率。

不同時(shí)間對(duì)大黃素的提取效果：振蕩提取時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min，取浸提液過(guò)濾后測(cè)定提取率。

不同料液比對(duì)大黃素的提取效果：取相同量虎杖粉在40 ℃下，按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）加入75%乙醇溶劑，浸提30 min，取浸提液過(guò)濾，測(cè)定提取率。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件

以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）為自變量，以虎杖大黃素提取率為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.5 大黃素的測(cè)定方法

取1 mL提取液，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾膜濾過(guò)、脫氣后按壽林均等[19]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑種類對(duì)虎杖大黃素提取率影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，用95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水以及乙醚對(duì)虎杖大黃素進(jìn)行提取，其中以95%乙醇的提取率最高，且乙醇無(wú)毒、安全性高。因此，選用乙醇作為虎杖根大黃素的最佳溶劑。

2.2 不同溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)虎杖大黃素提取率的影響

從圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)提取率最高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高時(shí)，提取率有下降的趨勢(shì)。相關(guān)研究也表明乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)增加其他雜質(zhì)的溶出量，從而導(dǎo)致大黃素提取率的下降[17]。故選用75%的乙醇進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 不同提取溫度對(duì)虎杖大黃素提取率的影響

從圖3可以得出，隨著提取溫度的升高，虎杖大黃素的提取率先上升后下降，當(dāng)提取溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高，隨后開始下降。相關(guān)研究也表明溫度升高能加快大黃素溶解到乙醇中，但是當(dāng)溫度達(dá)到一定值時(shí)，提取率下降是因?yàn)槠叩臏囟仍斐扇軇┑膿]發(fā)和大黃素分子的部分氧化分解[17]。

圖1 不同溶劑種類對(duì)虎杖大黃素提取率的影響

圖2 不同溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)大黃素提取率的影響

圖3 不同提取溫度對(duì)大黃素提取率的影響

2.4 不同提取時(shí)間對(duì)虎杖大黃素提取率的影響

從圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，虎杖大黃素的提取率先上升后下降，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)提取率達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率開始有下降的趨勢(shì)。劉樹興等[18]采用80%乙醇+丙酮超聲提取大黃素也發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間到達(dá)巔峰后會(huì)輕微緩慢下降，其原因可能是發(fā)生部分氧化。因此，提取時(shí)間選取30 min為宜。

2.5 不同料液比對(duì)虎杖大黃素提取率的影響

從圖5可以得出，隨溶劑體積增加，大黃素的提取率先上升后趨于穩(wěn)定，1∶15（g/mL）后上升緩慢，為確保充分提取，實(shí)際操作選擇料液比1∶20（g/mL）進(jìn)行提取。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)大黃素提取率的影響

圖5 不同料液比對(duì)大黃素提取率的影響

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖根大黃素提取工藝

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由于料液比在1∶20（g/mL）時(shí)提取率基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，兼顧提取效率與節(jié)省溶劑，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）按表1對(duì)虎杖中大黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.6.2 數(shù)據(jù)模型建立與回歸分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，回歸方程為：

Y=0.58+0.002 25A+0.001 125B+0.004 125C+0.002 25AB-0.000 75AC-0.011A2-0.019B2-0.031C2

一次項(xiàng)系數(shù)值的大小可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，由回歸方程可得出提取虎杖根大黃素的主次影響因素順序?yàn)椋航釡囟龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間。

2.6.3 回歸模型的方差分析

為進(jìn)一步確定模型可靠性，通過(guò)軟件得到的模型方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中可知，模型中p＜0.000 1，說(shuō)明此次試驗(yàn)采用的二次模型是十分顯著的。p、p、p2、p2、p2ACABC的值均小于0.05，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與三個(gè)因素的二次項(xiàng)均具有顯著影響；而提取時(shí)間、交互項(xiàng)及失擬項(xiàng)項(xiàng)顯著性較差。失擬項(xiàng)p=0.066 7＞0.05，表明無(wú)失擬因素存在，各因素的效應(yīng)關(guān)系為提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.6.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面的坡度陡峭程度說(shuō)明影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小[20]。從3D響應(yīng)面圖（圖6～圖8）可以看出，各個(gè)因素對(duì)大黃素提取得率的影響程度。圖8的響應(yīng)面較為陡峭，說(shuō)明超聲時(shí)間和浸提時(shí)間的交互作用較大，但是由表3可知，三個(gè)交互作用均未達(dá)到顯著性水平。

2.6.5 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)軟件回歸方程對(duì)虎杖大黃素進(jìn)一步優(yōu)化，由以上結(jié)果分析得到最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)75.51%、提取時(shí)間30.34 min、提取溫度40.65 ℃、料液比1∶20（g/mL）。結(jié)合實(shí)際條件，最佳工藝選取75.5%乙醇、提取溫度40.6 ℃、提取時(shí)間30 min，經(jīng)3次平行試驗(yàn)測(cè)得平均提取率為0.577%，與預(yù)測(cè)值0.579%相近，相對(duì)誤差為0.35%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖中大黃素提取工藝條件是合理可行的。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)虎杖大黃素提取交互作用

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)虎杖大黃素提取交互作用

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖根大黃素的提取工藝條件，得出虎杖根大黃素的最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)75.5%、提取時(shí)間30 min、提取溫度40.6 ℃、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下大黃素得率可達(dá)0.577%。