PEG 化羥甲基小白菊內(nèi)酯抗腫瘤前藥納米顆粒的制備及性能

屈文豪， 楊全軍， 黃 平， 黃 衛(wèi)， 顏德岳

（1. 上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，金屬基復(fù)合材料國家重點實驗室，上海 200240；2. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 200233）

小白菊內(nèi)酯（PTL）是從菊科植物中提取出來的一類倍半萜內(nèi)酯天然產(chǎn)物，對乳腺癌、結(jié)腸癌和白血病等眾多癌癥具有良好的生物活性[1,2]。PTL 主要通過與核因子（NF-κB）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（STATs）、應(yīng)激活化蛋白酶（JNK）等多種信號通路中的蛋白相互作用以及誘導(dǎo)細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）來調(diào)控細胞中的各類免疫應(yīng)答反應(yīng)[3-6]。小白菊內(nèi)酯衍生物羥甲基小白菊內(nèi)酯（MMB）的生物活性與小白菊內(nèi)酯類似，可從洋玉蘭的根皮中提取得到[7]，也可在二氧化硒/過氧化叔丁醇（SeO2/tBuOOH）催化下由PTL 經(jīng)氧化反應(yīng)得到[8,9]。與PTL 相比，由于MMB 的C-14 位上引入一個伯羥基，故可對其進行進一步化學(xué)修飾，以提高其水溶性、生物利用度及靶向能力。例如，Yang 等[10]通過化學(xué)修飾，在MMB 的C-14 位點引入不同基團構(gòu)建了一系列衍生物，其中部分衍生物顯示出較高的抗癌活性。Janganati 等[11]合成了一系列MMB 的氨基甲酸酯和碳酸酯二聚體衍生物，可有效改善其水溶性，并評估了所得衍生物對血液腫瘤和實體腫瘤細胞（如結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)細胞瘤等）的抗癌活性。上述化學(xué)修飾在一定程度上改善了MMB 的水溶性，部分衍生物的抗癌活性還有所提高，但仍屬于小分子化合物，存在在人體內(nèi)血液停留時間短、生物利用度低且選擇性差等問題。

近年來，納米藥物載體的輸送體系發(fā)展日新月異[12,13]。納米藥物載體在藥物輸送上具有獨特的優(yōu)勢，通過實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR），它們可被動靶向到腫瘤部位并富集[14,15]，進一步通過胞吞的方式大量進入腫瘤細胞，釋放出藥物，發(fā)揮良好的治療作用[16,17]。目前，已報道了大量基于納米藥物載體的藥物輸送體系[18-20]，如：Chang 等[21]采用嵌段共聚物聚（乙二醇）-b-聚（ε-己內(nèi)酯-co-γ-羥基-ε-己內(nèi)酯）自組裝負載化療藥物阿霉素，得到粒徑為100~140 nm 的載藥膠束，該膠束具有較高的載藥量、良好的緩釋作用和抗腫瘤活性；韓克等[18]設(shè)計了一類水溶性多糖并將其作為化療藥物多柔比星的載體，制得了聚電解質(zhì)復(fù)合藥物納米顆粒，載藥納米顆粒的穩(wěn)定性較高，細胞攝取顯著增強。然而，大多數(shù)納米藥物載體不易通過美國食品藥物管理局（FDA）的認證，臨床應(yīng)用困難。聚乙二醇（PEG）是目前FDA 批準(zhǔn)的少數(shù)可用于人體的醫(yī)用聚合物敷料，并已廣泛應(yīng)用于藥物輸送領(lǐng)域[22]。經(jīng)PEG 修飾的小分子藥物可自組裝形成納米顆粒，具有較長的體內(nèi)循環(huán)時間、較小的生物毒性、較高的生物利用度和較好的治療效果[23]，如PEG 修飾的喜樹堿、紫杉醇等納米藥物目前已進入臨床試驗階段[24]。

本文采用PEG 對MMB 進行修飾，構(gòu)建一類基于MMB 的前藥納米顆粒，詳細研究思路如圖1 所示。首先，在二環(huán)己基碳二亞胺/4-二甲氨基吡啶（DCC/DMAP）催化下，由MMB 與羧基聚乙二醇單甲醚（mPEG10-COOH）經(jīng)一步酯化反應(yīng)縮合得到兩親性前藥mPEG10-MMB，然后在水中自組裝形成mPEG10-MMB 前藥納米顆粒，當(dāng)mPEG10-MMB 前藥納米顆粒進入腫瘤細胞后，在腫瘤細胞的酸性環(huán)境中，酯鍵降解并釋放出MMB，從而有效殺死腫瘤細胞。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

圖 1 兩親性前藥mPEG10-MMB 的合成、自組裝及藥物輸送Fig. 1 Synthesis, self-assembly and drug delivery of amphiphilic mPEG10-MMB prodrug

4-二甲氨基吡啶（DMAP，純度99%）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，純度99%）、尼羅紅（NR，純度99%）：百靈威（J&K）試劑公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）：純度99%，西格瑪（Sigma）試劑公司；MMB：上海市第六人民醫(yī)院藥劑科提供；mPEG10-COOH：Mn= 550，Mw/Mn＜1.05，上海炎怡生物科技有限公司；二氯甲烷（DCM）：上海阿拉?。ˋladdin）生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無水硫酸鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；人宮頸癌細胞（HeLa 細胞）：中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所；胎牛血清（FBS）、杜爾貝科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7.4）、多聚甲醛：PAA 公司；透析袋：Mw= 1 000，綠鳥科技有限公司。

1.2 測試與表征

采用Varian 公司Mercury plus-400 型核磁共振波譜儀測試樣品的核磁共振氫譜（1H-NMR），測試溫度25 °C，溶劑CDCl3，內(nèi)標(biāo)三甲基硅烷（TMS）；采用Waters 科技有限公司Q-TOF Premier 型超高分辨液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用儀分析測試樣品分子量，洗脫劑為乙腈-超純水（體積比為1∶1）；采用珀金埃爾默有限公司Lam UV-Vis 型紫外-可見分光光度計測試樣品紫外吸收光譜，測試溫度25 °C，掃描波長范圍200～650 nm，速率為480 nm/min；采用英國馬爾文儀器有限公司Zetasizer Nano ZS 型動態(tài)光散射（DLS）分析儀測試前藥納米顆粒粒徑，測試溫度25 °C，散射角90°；采用日本電子株式會社JEOL JEM-CX-II 透射電子顯微鏡（TEM）測試前藥納米顆粒形貌，加速電壓為200 kV；采用美國BD 公司LSRFortessa 流式細胞儀記錄細胞攝取數(shù)據(jù)；采用德國徠卡（Leica）公司TCS SP8 STED 3X 型活細胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡（CLSM）拍攝前藥納米顆粒進入細胞圖像。

1.3 mPEG10-MMB 兩親性前藥的合成

mPEG10-MMB 兩親性前藥由mPEG10-COOH 與MMB 通過酯化反應(yīng)合成得到，具體制備過程如下：在50 mL單口圓底燒瓶中，依次加入mPEG10-COOH（208 mg，0.378 mmol）、DCC（93.6 mg，0.454 mmol）和10 mL 無水二氯甲烷，0 °C 下攪拌30 min 使固體全部溶解。然后，將5 mL 溶有MMB（50 mg，0.190 mmol）和DMAP（51.7 mg，0.423 mmol）的二氯甲烷溶液加入上述燒瓶中，室溫下避光反應(yīng)48 h 后，過濾除去白色沉淀，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑得到固體粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用二氯甲烷重新溶解、過濾并收集濾液。濾液用去離子水洗滌2 次，飽和NaHCO3溶液洗滌1 次，再用去離子水洗滌1 次，最后加入無水Na2SO4干燥過夜。過濾除去Na2SO4，收集有機層并濃縮得到固體。將固體溶于少量DMSO 中并轉(zhuǎn)移至透析袋中，用去離子水透析24 h，透析液經(jīng)冷凍干燥得到白色固體產(chǎn)物102.3 mg（產(chǎn)率43%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.24 （s，1H），6.24 （s，1H），5.57 （t，1H），4.70 （s，1H），4.49 （s，1H），4.25 （d，2H），3.85 （s，2H），3.64 （m，101H），3.56 （s，3H），3.38 （s，3H），2.85 （s，2H），2.64 （d，J = 14.3 Hz，5H），2.42 （m，2H），2.22 （s，7H），1.55 （s，4H），1.25 （s，16H），1.12 （s，4H），0.87 （s，2H）。

1.4 mPEG10-MMB 兩親性前藥的自組裝

稱取5 mg mPEG10-MMB 溶于1 mL DMSO 中，采用微量注射泵以0.8 mL/h 滴加速率將該溶液緩慢滴加到4 mL 攪拌的超純水中。滴加完畢后，將組裝體溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中進行透析，每4 h 更換一次去離子水，共透析24 h。透析結(jié)束后，測得其組裝體溶液體積為15 mL，質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL。

1.5 負載NR mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的制備

將5 mg mPEG10-MMB 溶于1 mL DMSO 中，然后加入0.2 mL NR 質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的DMSO 溶液，室溫振蕩2 min。采用微量注射泵以0.8 mL/h 滴加速率將上述溶液緩慢滴加到4 mL 攪拌的超純水中，滴加完畢后，將組裝體溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，用去離子水透析24 h，每4 h 換1 次去離子水。透析結(jié)束后，得到負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒溶液。

1.6 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒臨界膠束濃度的測定

mPEG10-MMB 前藥在水中形成納米顆粒的臨界膠束濃度（CMC）采用尼羅紅熒光探針法測定。將10 μL NR 的丙酮溶液（濃度為2 × 10?4mol/L）加入到1 mL 不同質(zhì)量濃度的mPEG10-MMB 前藥水溶液中，室溫攪拌過夜，使丙酮完全揮發(fā)，NR 的終濃度為2 × 10?6mol/L，而mPEG10-MMB 前藥的質(zhì)量濃度為0.005～200 μg/mL。采用LS-50B 型熒光光譜儀測定不同濃度mPEG10-MMB 水溶液的熒光光譜，激發(fā)波長設(shè)為550 nm，光柵寬帶為10 nm。記錄不同mPEG10-MMB 前藥濃度水溶液熒光光譜中NR 的最大熒光發(fā)射強度，并以最大熒光發(fā)射強度對mPEG10-MMB 前藥的對數(shù)質(zhì)量濃度作圖，曲線拐點對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為mPEG10-MMB 前藥在水中的CMC。

1.7 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的細胞內(nèi)攝

采用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測HeLa 細胞對mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的攝取情況。

流式細胞儀測試：將HeLa 細胞以每孔5.0 × 105個的密度鋪在六孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。細胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，加入2 mL 負載NR（NR 質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL）的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒無血清DMEM 溶液，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中分別孵育1、2、4 h 后，除去培養(yǎng)基，用冷PBS 洗滌3 次。使用胰蛋白酶消化細胞并收集于流式管中。采用BD LSRFortessa 流式細胞儀收集并分析門內(nèi)1.0 × 104個細胞的熒光數(shù)據(jù)。

激光共聚焦顯微鏡測試：將直徑為20 mm 的圓形蓋玻片置于6 孔板中，然后將HeLa 細胞以每孔5.0 ×105個細胞的密度接種到6 孔板中。24 h 后，吸取培養(yǎng)基，加入1 mL 負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒無血清DMEM 溶液，納米顆粒的濃度為30 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后除去DMEM 培養(yǎng)基，用冷PBS 洗滌3 次，每次漂洗5 min，隨后加入w=4%的多聚甲醛固定細胞，室溫下避光30 min。細胞固定好后，吸去多聚甲醛，并用冷PBS 漂洗3 次。然后加入1 mL DAPI 染液（2 μg/mL），室溫下避光染色10 min。染色結(jié)束后，除去DAPI染液，用冰PBS 洗滌3 次，每次5 min，最后再用超純水漂洗1 遍。將一側(cè)有細胞的蓋玻片覆蓋在滴有少量抗熒光淬滅劑的載玻片上固定，避光保存樣品，采用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

1.8 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的細胞毒性測試

通過MTT 法分別測定了mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對正常細胞和腫瘤細胞的毒性。

選用大鼠正常肝細胞（BRL-3A）細胞株，研究mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對正常細胞的毒性。首先將BRL-3A 細胞按每孔5 × 103個的密度，將正常細胞接種在96 孔板中，置于CO2體積分數(shù)為5%的37 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，更換新的培養(yǎng)基，設(shè)定不同濃度梯度的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒（0.1～100 μmol/L）溶液，細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每個孔中加入20 μL MTT 的PBS 溶液（5 mg/mL）。避光培養(yǎng)4 h后，除去含有未反應(yīng)MTT 的培養(yǎng)基，隨后每孔中加入200 μL DMSO，振蕩10 min 充分溶解藍紫色結(jié)晶甲臜，用BIO-RAD Model 680 型酶標(biāo)儀在490 nm 處測量每個孔的吸光度值，細胞存活率（SC）由以下公式計算得到：

公式中：As為實驗組吸光度值（含有細胞的培養(yǎng)基，MTT，藥物）；Ab為空白對照組吸光度值（不含細胞和藥物的培養(yǎng)基，MTT）；Ac為陰性對照組吸光度值（含有細胞的培養(yǎng)基，MTT，沒有加藥）。其中，空白對照組細胞存活率設(shè)定為100%。

選用HeLa 細胞株，研究mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對腫瘤細胞的毒性，具體操作步驟同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩親性前藥mPEG10-MMB 的結(jié)構(gòu)表征

MMB、mPEG10-COOH、mPEG10-MMB 的1H-NMR 譜圖見圖2。比較圖2 的核磁共振氫譜可以看出，酯化反應(yīng)產(chǎn)物中同時出現(xiàn)了原料mPEG10-COOH 和MMB 的特征峰，其中MMB 的羥基與mPEG10-COOH 的羧基反應(yīng)形成酯鍵后，其臨近亞甲基上質(zhì)子信號峰的化學(xué)位移從4.14（1）移動到4.69（1'），而MMB 中雙鍵的質(zhì)子信號峰的化學(xué)位移僅從6.23（2）略微移動至6.24（2'），這是由于其遠離酯化反應(yīng)位點，故化學(xué)位移變化不明顯。同時，化學(xué)位移在3.50～3.70 和3.33 分別屬于mPEG10-COOH 中重復(fù)單元―CH2―CH2O―和末端單元―OCH3的特征信號峰（b+c）和（a），在mPEG10-MMB 的1H-NMR 譜圖中也相應(yīng)出現(xiàn)（b'+c'）和（a'），且化學(xué)位移基本保持不變?？梢?，本文成功合成了mPEG10-MMB 前藥。

圖 2 樣品的1H-NMR 譜圖Fig. 2 1H-NMR spectra of samples

兩親性前藥mPEG10-MMB 以及原料mPEG10-COOH 的LC-MS 譜圖如圖3 所示。兩者的LC-MS 譜圖中均出現(xiàn)了一系列不同Mn信號峰和對應(yīng)的保留時間，相鄰的峰與峰之間Mn之差為44，與PEG 中重復(fù)單元（―CH2―CH2―O―）的分子量一致，說明mPEG10-COOH 的Mn存在一定分布。根據(jù)mPEG10-MMB 前藥合成反應(yīng)方程式，原料與產(chǎn)物數(shù)均分子量應(yīng)滿足如下關(guān)系：Mn（mPEG10-MMB）= Mn（mPEG10-COOH） + Mn（MMB） ?18，即前藥mPEG10-MMB 與原料mPEG10-COOH 的數(shù)均分子之差應(yīng)接近MMB 的數(shù)均分子量264。從圖3中對應(yīng)的Mn信號峰可看出，mPEG10-MMB 的Mn比mPEG10-COOH 的Mn多出262.14，與上述理論公式的計算結(jié)果基本一致，進一步證明mPEG10-MMB 前藥的成功合成。

圖 3 mPEG10-COOH 和mPEG10-MMB 前藥的LC-MS 譜圖Fig. 3 LC-MS spectra of mPEG10-COOH and mPEG10-MMB prodrug

mPEG10-MMB 前藥在乙腈溶液中的UV-Vis 光譜如圖4 所示。從圖中可以看出，原料MMB 的吸收峰位于226 nm 處，mPEG10-COOH 的吸收峰位于208 nm 處，而mPEG10-MMB 前藥出現(xiàn)了兩個吸收峰，分別位于286 nm 和206 nm 處，也從另一個角度證明mPEG10-MMB 前藥的成功合成。

圖 4 mPEG10-COOH、MMB 和mPEG10-MMB 前藥的UV-Vis譜圖Fig. 4 UV-Vis spectra of mPEG10-COOH, MMB and mPEG10-MMB prodrug （ρ （Sample） = 20 μg/mL）

2.2 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的粒徑及形貌

分別采用DLS 和TEM 對mPEG10-MMB 前藥在水中自組裝得到的組裝體的表征結(jié)果如圖5 所示。從圖5（a）的DLS 結(jié)果可以看出，mPEG10-MMB前藥可在水中自組裝形成平均粒徑為120.3 nm，粒徑分布為0.207 的聚集體。而從圖5（b）的TEM 照片可以看出，mPEG10-MMB 前藥在水中自組裝形成的聚集體為平均粒徑約108.5 nm 的球形納米顆粒。TEM 測得的平均粒徑比DLS 測得的小了約11.8 nm，這是由于TEM 測試中樣品處于干態(tài)，而DLS 測試樣品處于濕態(tài)所致。

圖 5 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的（a）DLS 曲線和（b）TEM 照片F(xiàn)ig. 5 （a） DLS curve and （b） TEM image of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles

2.3 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的CMC

水溶液中NR 的最大熒光發(fā)射強度與mPEG10-MMB 前藥質(zhì)量濃度的關(guān)系如圖6 所示。在550 nm的激發(fā)光下，當(dāng)mPEG10-MMB 的質(zhì)量濃度較低時，NR 的最大熒光發(fā)射強度較弱且?guī)缀醣３植蛔儯f明只有少量的疏水性NR 分子分散在水相中。當(dāng)mPEG10-MMB 前藥質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到某一特定值時，NR 的最大熒光發(fā)射強度突然增加，快速達到NR 分子完全處于疏水環(huán)境中的數(shù)值。NR 的最大熒光發(fā)射強度發(fā)生突變說明，mPEG10-MMB 前藥在水中發(fā)生了微相分離，形成了一定的疏水微區(qū)（即自組裝形成了膠束）。根據(jù)圖6中曲線的拐點，可以得到mPEG10-MMB 前藥的CMC 約為7.7 μg/mL。

2.4 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的細胞內(nèi)攝

選用HeLa 細胞對mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的細胞內(nèi)攝情況進行研究。由于mPEG10-MMB 前藥納米顆粒自身沒有熒光，故選用NR 作為熒光探針并將其負載到mPEG10-MMB 前藥納米顆粒中，然后與HeLa 細胞共同孵育指定時間并采用流式細胞儀進行分析，結(jié)果如圖7 所示。從圖中可以看出，HeLa 細胞內(nèi)的NR 熒光強度隨著孵育時間的增加而變強，這說明隨著負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒與HeLa 細胞孵育時間的增加，越來越多的負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒進入HeLa 細胞內(nèi)，導(dǎo)致其熒光強度增強。

圖 6 NR 的最大熒光發(fā)射強度與mPEG10-MMB 前藥質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig. 6 Maximum emission intensity of NR versus the mass concentration of mPEG10-MMB

圖 7 與封裝NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒孵育不同時間后HeLa 細胞內(nèi)的幾何平均熒光強度（插圖為未處理的（a）HeLa 細胞和（b）封裝NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒培養(yǎng)4 h 后的Hela 細胞分別測得的流式細胞曲線）Fig. 7 Time-dependent profiles of NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles fluorescence intensity in HeLa cells（Insert: （a） representative flow cytometry histogram profiles of untreated Hela cells and （b） HeLa cells incubated with NRloaded mPEG10-MMB prodrug for 4 h）

Hela 細胞與負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒一起培養(yǎng)4 h，并用DAPI 對細胞核染色，然后進行CLSM 測試，結(jié)果如圖8 所示（其中：微分干涉差（DIC）圖為原始Hela 細胞照片，DAPI 圖為染色的Hela 細胞核照片，NR 圖為負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒與Hela 細胞共培養(yǎng)后的照片，疊加（Merge）圖為DAPI 和NR 照片的疊加圖）。從Merge 圖中可以看出，負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒可被癌細胞有效攝取。流式細胞儀和CLSM 的測試結(jié)果都表明mPEG10-MMB 前藥納米顆粒能有效進入腫瘤細胞中。

圖 8 負載NR 的mPEG10-MMB 前藥納米顆粒與HeLa細胞培養(yǎng)4 h 的激光共聚焦顯微鏡照片（細胞核用DAPI 染色）Fig. 8 CLSM images of HeLa cells incubated with NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles for 4 h （Cell nuclei are stained with DAPI）

2.5 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的體外抗腫瘤活性

采用MTT 法評估了mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對HeLa 細胞增殖的抑制效果。MTT 法又稱MTT比色法，常用來檢測細胞存活率和生長，其基本原理是活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將MTT 還原為水中不溶解的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積于細胞中，而死細胞卻沒有這種功能。用DMSO 溶解細胞中生成的甲瓚得到的藍紫色溶液，其在490 nm 波長處有特征吸收，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定該波長處的光吸收值，即可間接反映出活細胞的數(shù)量。在一定的細胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的藍紫色甲瓚量與活細胞數(shù)成正比。分別將MMB 和mPEG10-MMB 前藥納米顆粒與HeLa 細胞培養(yǎng)72 h 后，用MTT 法測得細胞毒性，結(jié)果如圖9 所示。從圖中可以看出，mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對HeLa 細胞生長的抑制效果明顯優(yōu)于MMB，它們的半抑制濃度分別為13 μmol/L 和24 μmol/L，這是由于mPEG10-MMB 前藥納米顆粒具有被動靶向作用，可被癌細胞內(nèi)吞并在癌細胞內(nèi)富集，由于癌細胞內(nèi)環(huán)境呈微酸性，促使mPEG10-MMB 前藥中的酯鍵降解，釋放出MMB，從而有效抑制腫瘤細胞的增殖。

2.6 mPEG10-MMB 前藥納米顆粒的細胞毒性

通過MTT 實驗評價了mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對BRL-3A 正常細胞的毒性。BRL-3A 正常細胞的存活率與mPEG10-MMB 前藥納米顆粒濃度的關(guān)系如圖10 所示。隨著mPEG10-MMB 納米顆粒濃度的提高，BRL-3A 細胞的存活率雖有一定程度的下降，但相比于相同藥物濃度下HeLa 腫瘤細胞的存活率，其仍要高出2 倍左右。例如當(dāng)mPEG10-MMB 前藥納米顆粒濃度為100 μmol/L 時，BRL-3A 正常細胞的存活率約為60%，而HeLa 腫瘤細胞的存活率僅約為20%不到。由此可見，mPEG10-MMB 前藥納米顆粒在有效抑制腫瘤細胞的同時，對正常細胞毒性相對較低，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

圖 9 MTT 法測得的MMB 和mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對HeLa 細胞的細胞毒性Fig. 9 In vitro cytotoxicity of MMB and mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to HeLa cells determined by MTT assay

圖 10 MTT 法測得mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對BRL-3A細胞的細胞毒性Fig. 10 In vitro cytotoxicity of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to BRL-3A cells determined by MTT assay

3 結(jié) 論

（1）通過mPEG10-COOH 與MMB 之間的一步酯化反應(yīng)偶聯(lián)得到兩親性前藥mPEG10-MMB。

（2）兩親性前藥mPEG10-MMB 可在水中自組裝形成納米顆粒，可實現(xiàn)MMB 的被動靶向輸送。

（3）mPEG10-MMB 前藥納米顆粒可通過內(nèi)吞方式被腫瘤細胞攝取。

（4）與MMB 小分子藥相比，mPEG10-MMB 前藥納米顆粒對HeLa 腫瘤細胞增殖具有更好的抑制作用，同時，對正常細胞的毒性相對較低。