氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定2-氰基溴芐中3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的含量

莊 航

(宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所,宿遷223800)

苯甲酸阿格列汀是以3-甲基-6-氯尿嘧啶和2-氰基溴芐為起始原料,在堿性條件下發(fā)生烷基化反應(yīng)得到2-(6-氯-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氫-2H-嘧啶-1-基甲基)-芐腈,再與(R)-3-氨基哌啶二鹽酸發(fā)生取代反應(yīng)得到(R)-2-[(6-(3-氨基哌啶-1-基)-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2 H)-基)甲基]芐腈(阿格列汀游離堿),阿格列汀游離堿再與苯甲酸成鹽得到苯甲酸阿格列汀[1-5]。由于2-氰基溴芐是合成苯甲酸阿格列汀的關(guān)鍵起始原料[6],其產(chǎn)品的質(zhì)量直接影響苯甲酸阿格列汀的安全性,需要嚴(yán)格控制。2-氰基溴芐在合成過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生少量的同分異構(gòu)體3-氰基溴芐和4-氰基溴芐副產(chǎn)物[7-8]。2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐均為含鹵代烷烴類結(jié)構(gòu)的基因毒性雜質(zhì),需要對(duì)2-氰基溴芐中的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的殘留量進(jìn)行控制,以降低苯甲酸阿格列汀中基因毒性雜質(zhì)的水平[9-12]。參考ICH M7基因毒性雜質(zhì)評(píng)估和控制指導(dǎo)原則中潛在基因毒性雜質(zhì)限度制定依據(jù),以毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC,1.5μg·d－1)法計(jì)算[10],苯甲酸阿格列汀的最大日劑量為25 mg,2-氰基溴芐中同類基因毒性雜質(zhì)所允許的最大殘留量為60 mg·L－1。

經(jīng)查詢,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離檢測(cè)方法的研究報(bào)道。本工作采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)結(jié)合中等極性的毛細(xì)管色譜柱同時(shí)分離了上述3種化學(xué)性質(zhì)相似的同分異構(gòu)體極性化合物,可快速準(zhǔn)確測(cè)定2-氰基溴芐中潛在基因毒性雜質(zhì)3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的殘留量,以期為苯甲酸阿格列汀的用藥安全提供保障。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫7890B-7000C型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,配Mass Hunter工作站軟件,XPE56DR型電子天平。

3-氰基溴芐和4-氰基溴芐混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻,配制成1 000 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液100μL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混合搖勻,配制成10 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;再移取10 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混合搖勻,配制成100μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:稱取試樣約25 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻后,移取1 mL于10 mL容量瓶中,加入100μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 mL,用乙腈稀釋至刻度,混合均勻。

空白溶液:乙腈。

3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為98.86%;待測(cè)樣品中2-氰基溴芐的純度不小于99%;乙腈為色譜級(jí)。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 以50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷為固定液的VF-17MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進(jìn)樣口溫度為260℃;載氣為氦氣(純度為99.999%),流量為1.5 mL·min－1;碰撞氣為氮?dú)?純度為99.999%),流量為1.5 mL·min－1;淬滅氣為氦氣(純度為99.999%),流量為2.25 mL·min－1;進(jìn)樣量為 1μL;襯管為 5190-2295型分流襯管;進(jìn)樣口為多模式進(jìn)樣口;分流進(jìn)樣,分流比為5∶1。柱升溫程序:初始溫度為60℃;以20℃·min－1的速率升溫至180℃;再以5℃·min－1的速率升溫至185℃,保持2 min;最后再以40℃·min－1的速率升溫至300℃,保持2 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;氰基溴芐的定性離子對(duì)的質(zhì)荷比m/z為116/63,116/116,碰撞能量分別為35,10 e V;定量離子對(duì)的質(zhì)荷比m/z為116/89,碰撞能量為15 e V。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取待測(cè)樣品25 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻,得到待測(cè)樣品溶液。移取待測(cè)溶液1μL,按照儀器工作條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

3種氰基溴芐均為沸點(diǎn)較高的極性化合物,試驗(yàn)首先考慮采用弱極性的HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.320 mm,0.25μm)對(duì)2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐進(jìn)行分離,為了縮短分析時(shí)間,色譜柱升溫程序設(shè)定為:初始溫度為60℃,維持3 min,再以20℃·min－1的速率升溫至170℃,保持5 min。載氣流量為1.5 mL·min－1,分流進(jìn)樣,分流比為20∶1。向待測(cè)樣品中加入3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述儀器工作條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在HP-5毛細(xì)管色譜柱下的分離色譜圖Fig.1 Separation chromatogram of 2-cyanobenzyl bromide,3-cyanobenzyl bromide and 4-cyanobenzyl bromide under HP-5 capillary column

結(jié)果表明:4-氰基溴芐和3-氰基溴芐對(duì)應(yīng)的相鄰色譜峰的分離度為1.35,小于1.5,說(shuō)明未實(shí)現(xiàn)基線分離。

試驗(yàn)進(jìn)一步采用DB-5HT毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.250 mm,0.1μm)對(duì)2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐進(jìn)行分離,該色譜柱經(jīng)交聯(lián)、鍵合,對(duì)高沸點(diǎn)組分可提供更快速的洗脫效率和更好的分離效果。色譜柱升溫程序設(shè)定為:初始溫度為45℃,保持3 min;以20℃·min－1的速率升溫至120℃,保持5 min;再以30℃·min－1的速率升溫至210℃,保持1 min。按照上述儀器工作條件對(duì)2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐對(duì)應(yīng)的相鄰色譜峰的分離度提高至1.9,大于1.5,實(shí)現(xiàn)了基線分離,但是在2-氰基溴芐供試品溶液中4-氰基溴芐和3-氰基溴芐出峰與2-氰基溴芐部分重合,導(dǎo)致該色譜條件下,4-氰基溴芐和3-氰基溴芐的回收率高于150%。

考慮到2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐均為含氰基極性基團(tuán)的化合物,試驗(yàn)選擇將弱極性毛細(xì)管柱更換為中等極性固定液的毛細(xì)管柱,以增加固定液與三者的偶極作用。以VF-17MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)為分析柱,在1.2節(jié)處的柱升溫程序下進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離度可達(dá)2.8,表明VF-17MS分離效果高于另外兩種弱極性毛細(xì)管柱,色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在VF-17MS毛細(xì)管色譜柱下的分離色譜圖Fig.2 Separation chromatogram of 2-cyanobenzyl bromide,3-cyanobenzyl bromide and 4-cyanobenzyl bromide under VF-17MS capillary column

2.1.2 柱溫

以VF-17MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)為分析柱,在0～20 min內(nèi),色譜柱的溫度先由50℃升溫至300℃,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐、4-氰基溴芐的出峰時(shí)間分別為8.126,8.451,8.527 min(見(jiàn)圖3,圖3中柱升溫程序A:0～20 min內(nèi),溫度由50℃升溫至300℃;柱升溫程序B:初始溫度60℃,以20℃·min－1的速率升溫至180℃;再以5℃·min－1的速率升溫至185℃,保持2 min;最后以40℃·min－1的速率升溫至300℃,保持2 min)。VF-17MS毛細(xì)管色譜柱的死時(shí)間為1.470 min,扣除死時(shí)間后得到化合物的調(diào)整保留時(shí)間分別為6.656,6.981,7.057 min,該時(shí)間對(duì)應(yīng)的柱溫箱溫度即為該化合物的特征流出溫度,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐、4-氰基溴芐的特征流出溫度分別為183.12,189.62,191.14℃。因?yàn)闅庀嗌V儀采用氣浴加熱方式,柱溫箱溫度會(huì)略微高于色譜柱實(shí)際溫度,且升溫速率越大該差值越大[13-15]。當(dāng)以20℃·min－1的升溫速率加熱時(shí),需要將柱溫箱溫度扣減5℃得到色譜柱溫度,2-氰基溴芐的流出溫度大致為180℃,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的流出溫度約為185℃。試驗(yàn)中采用快速升溫的方式升溫至180℃使得2-氰基溴芐流出,后緩慢升溫至185℃,在該溫度下恒溫一倍的色譜柱死時(shí)間以提高3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離度,最后快速升溫至300℃,老化色譜柱。

圖3 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在不同的色譜柱升溫程序下的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatogram of 2-cyanobromobenzyl,3-cyanobromobenzyl and 4-cyanobromobenzyl under different chromatographic column heating procedure

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)譜基峰均為116,根據(jù)結(jié)構(gòu)式可知碎片均來(lái)自于氰芐基。采用子離子掃描方式,選擇質(zhì)荷比(m/z)116作為初級(jí)離子,碰撞能量設(shè)置為10,15,25,35 eV,子離子掃描m/z范圍為50～150。分析質(zhì)譜子離子掃描數(shù)據(jù)顯示m/z116能得到m/z為89和63兩個(gè)碎片離子,同時(shí)未打碎的m/z116處也有較強(qiáng)響應(yīng)。由結(jié)果得知最佳信噪比離子對(duì)的m/z為116/89,選擇該離子對(duì)為定量離子對(duì);m/z為116/63和m/z116/116離子對(duì)作為定性離子對(duì)。2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的最佳碰撞能量分別為15,35,10 e V,且3種化合物質(zhì)譜信息一致。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

配制質(zhì)量濃度分別為5,15,22.5,30μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,以3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)量濃度均在5.0～30.0μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之間呈線性關(guān)系,3-氰基溴芐的線性回歸方程為y＝2.996×103x－2.693×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 8,y軸截距比100%響應(yīng)值為6.3%;4-氰基溴芐的線性回歸方程為y＝2.659×103x－3.710×103,相關(guān)系數(shù)為0.998 7,y軸截距比100%響應(yīng)值為10%。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N),以10倍的信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的檢出限均為2.0μg·L－1,測(cè)定下限均為5.0μg·L－1。

2.4 精密度試驗(yàn)

平行配制6份系統(tǒng)適用性溶液,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):3-氰基溴芐測(cè)定值的RSD為1.2%,4-氰基溴芐測(cè)定值的RSD為3.3%,說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

由不同的分析人員在不同的日期使用不同儀器按照上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):12份待測(cè)溶液中3-氰基溴芐測(cè)定值的RSD為4.9%,4-氰基溴芐測(cè)定值的RSD為3.5%。表明該方法的再現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)陰性樣品進(jìn)行低、中和高等3種不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for precision

由表2可知:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的回收率分別為92.1%～97.0%和102%～109%。

2.6 溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

試驗(yàn)考察了待測(cè)樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液以及3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準(zhǔn)溶液在25℃條件下放置0,2,5,9,12,18 h后的峰面積變化情況。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)樣品溶液及系統(tǒng)適用性溶液在25℃條件下放置18 h后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的峰面積與放置0時(shí)相比,峰面積的相對(duì)偏差小于5%。表明各溶液在25℃條件下放置18 h后穩(wěn)定性良好。

2.7 專屬性試驗(yàn)

移取1.1節(jié)處的各溶液1μL注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,記錄其色譜圖。結(jié)果表明:空白溶液不干擾3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測(cè)定,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐保留時(shí)間分別為8.058,8.617,8.759 min,相鄰色譜峰的分離度分別為7.1,2.8。表明該方法專屬性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

試驗(yàn)通過(guò)改變載氣流量為(1.1±0.1)mL·min－1、分流比為4∶1～6∶1、電子轟擊能量變化范圍為－5～＋5 e V來(lái)評(píng)估試驗(yàn)條件有微小變化時(shí),3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測(cè)定結(jié)果的受影響程度。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中,電子轟擊能量變化范圍為－5～＋5 eV,分流比分別變?yōu)?∶1及6∶1后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測(cè)定值的RSD均小于5.0%;但是流量變化±0.1 mL·min－1后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測(cè)定值的RSD均大于5.0%,提示在選定的色譜條件下載氣的流量需準(zhǔn)確設(shè)定。

2.9 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)批號(hào)分別為ALOB1710009、ALOB1810007和ALOB1902002的3批樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:3批樣品中均未檢出3-氰基溴芐和4-氰基溴芐。

本工作采用GC-MS/MS結(jié)合中等極性的毛細(xì)管色譜柱同時(shí)分離測(cè)定了2-氰基溴芐中2種化學(xué)性質(zhì)相似的含鹵代烷烴類基因毒性結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體極性化合物,方法操作簡(jiǎn)便、分離度好,能快速測(cè)定2-氰基溴芐中潛在基因毒性雜質(zhì)3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的微量殘留,可為苯甲酸阿格列汀的用藥安全提供保障。