PD-L1和IFN-γ與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者免疫功能的關(guān)系＊

孟芳 ，廖永強 ，肖妮 ，戴森華 ，夏洪嬌 ，陳波

（江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，1.檢驗科；2.風濕免疫科，萍鄉(xiāng) 337000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus,SLE）是以產(chǎn)生多種身抗體為特征的自身免疫性疾病，免疫功能紊亂為SLE患者，尤其是活動期SLE患者的主要臨床特征[1]。細胞抗原分子表達失調(diào)、信號轉(zhuǎn)道、基因轉(zhuǎn)錄錯誤及細胞因子共同作用使SLE患者T 淋巴細胞分化異常，導致B 細胞活性失調(diào)而產(chǎn)生大量的自身抗體[2]。體外研究顯示[3]，程序性死亡分子1 ( programmed death 1,PD1)與可溶性程序性死亡分子配體1 ( programmed death ligand-1,PD-L1) 相互作用使SLE患者和健康人T淋巴細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生均具有抑制作用。另有研究顯示[4]，IFN-γ 抑制調(diào)節(jié)性 T 細胞（Treg）功能并增加Th17 細胞分化，誘導B 淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)的產(chǎn)生，促進B 細胞的活化產(chǎn)生致病性自身抗體。本研究通過檢測并比較分析活動期和非活動期SLE患者淋巴細胞表面和血清PD-L1、IFN-γ 表達水平，分析PD-L1 與IFN-γ 及體液免疫功能和疾病活動性相關(guān)指標的相關(guān)性，旨在探討SLE患者體內(nèi)PDL1 與IFN-γ 及它們與免疫功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象SLE組50例，均為 2018 年 1 月-2019 年12 月我院門診及住院SLE 患，均為女性患者，年齡 20-52 歲，平均年齡為(44.4±19.6)歲，所有患者均符合美國類風濕病學會2009 年修訂的SLE診斷標準[5]。根據(jù)活動性判定以SLEDAI-2000 為標準[6]，將 SLE患者分成活動組（18 例）和非活動組（32 例），平均年齡分別為 35.6±16.3 和 40.9±15.1。健康對照組，45 例，均為健康體檢者，其中男6 例，女39 例，平均年齡為(37.8±12.4)歲，無自身免疫性疾病，心肌酶譜、肝、腎功能正常。收集所有研究對象，包括健康對照的靜脈血血清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法與試劑 抗dsDNA 抗體滴度、PD-L1 與IFN-γ 血清水平檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒分別購自歐蒙醫(yī)學診斷(中國)有限公司和R&D Systems China；CD4+T 細胞、CD8+T 細胞和 CD19+B細胞表面PD-L1 分子表達采用貝克曼庫爾特FC500 流式細胞儀分析，小鼠抗人 IgG1-FITC、IgG1 -PE、CD3 -FITC、CD4 -FITC、CD8 -FITC、CD19-FITC、和紅細胞裂解液購自貝克曼庫爾特(中國)公司，小鼠抗人PD-L1-PE 單克隆抗體購自abcam 中國公司。免疫球蛋白 G、M 和 A、補體 C3、C4 采用貝克曼IMAGE800 全自動特定蛋白儀檢測，試劑購自貝克曼庫爾特(中國)公司。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學分析,計量資料以mean±SD 表示,計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,組間比較采用單因素方差分析； 圖表制作使用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism5.0，變量間的相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)進行分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者的一般資料及臨床特征 SLE患者一般資料及抗核抗體檢檢測情況與臨床特征見表1。健康對照組共納入45 例，男女比例為6/39，平均年齡為(37.8±12.4)歲。

表1 SLE 組與健康對照組一般人口學資料

2.2 SLE 組和健康對照組CD3+CD4+T 細胞、CD3+CD8+T 細胞和CD19+B 細胞表面PD-L1 分子表達的比較 PD-L1 在CD3+CD4+T 細胞上表達水平顯著高于健康對照組(均P<0.01)，且活動組顯著高于非活動組(P<0.01)，而在 CD8+T 細胞和 CD19+B 細胞表面PD-L1 分子表達顯著低于非活動組和健康組(均 P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 PD-L1 在SLE患者及健康對照組淋巴亞群上陽性表達率（±s）%

表2 PD-L1 在SLE患者及健康對照組淋巴亞群上陽性表達率（±s）%

注：*，與健康對照組比較，P<0.05；△，與dsDNA 抗體陰性組相比，P<0.05

組別 PD-L1+CD3+CD4+T cell PD-L1+CD3+CD8+T cell PD-L1+CD19+T cell活動組非活動組健康對照組18 32 45 25.05±2.66*△12.14±1.59*5.22±4.25 16.62±2.64*△18.66±2.40*18.86±1.87 4.82±1.44*△12.46±2.11*14.50±2.24

2.3 SLE患者和健康對照組外周血血清中PD-L1、IFN-γ 水平及疾病活動度指標的比較 活動組外周血清PD-L1 表達水平顯著低于非活動組和健康對照組(均P<0.01)，而IFN-γ 顯著高于非活動組和健康組(均P<0.01)，兩者在非活動組和健康組間無顯著性差異(P>0.05)。活動組 SLE患者 SLEDAI、血清抗dsDNA 抗體滴度和CRP 水平顯著高于非活動組和健康對照組(均P<0.01),且非活動組顯著高于健康組(P<0.01)，補體C3、C4 水平顯著低于非活動組和健康對照組(均P<0.01),且非活動組顯著低于健康組(P<0.05)，所有結(jié)果見表3。

2.4 SLE患者外周血清中PD-L1 表達水平與IFN-γ 及它們分別與疾病活動度指標的相關(guān)性分析通過對SLE患者外周血清中PD-L1 表達水平與IFN-γ 及它們分別與疾病活動度指標的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)，PD-L1 與 IFN-γ、SLEDAI、抗 dsDNA 抗體滴度和 CRP 呈負相關(guān) （均 P<0.01），結(jié)果見圖1b，1a，1c 和 1f，與補體 C3 和 C4 呈正相關(guān)（均 P<0.05），結(jié)果見圖1d 和 1e。

表3 SLE患者和健康對照組外周血血清中PD-L1、IFN-γ 水平及疾病活動度指標的比較

圖1 SLE患者外周血清中PD-L1 表達水平與疾病活動性指標的相關(guān)性

3 討論

SLE 為一種自身免疫性疾病，細胞免疫和體液免疫都存在異常，淋巴細胞亞群的異常在SLE 疾病進展中的作用一直是國內(nèi)外研究的熱點。先前研究[7]提示：活動期 SLE患者，CD4+T 細胞升高，CD8+T 細胞下降，CD4+/CD8+比值升高，SLE 發(fā)病 T淋巴細胞亞群的改變相關(guān)，尤其是CD8+下降引起B(yǎng) 細胞異常激活產(chǎn)生大量自身抗體。王友蓮等[8]卻發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者CD8+T 淋巴細胞反而升高，而 CD4+T 細胞減少，CD4+/CD8+比值下降。SLE患者免疫功能紊亂可能是體外環(huán)境的誘導、遺傳因素和體內(nèi)細胞因子共同作用的結(jié)果[9]，但是具體機理尚不清楚。PD-1/PD-L1 這對共刺激分子在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。PD-1 與PD-L1 結(jié)合后可以傳遞負性信號，降低T 細胞的活化程度和炎癥反應程度[10]。PD-1 與PD-L1結(jié)合還與免疫耐受相關(guān)，動物實驗發(fā)現(xiàn)PD-1 或者PD-L1 基因敲除小鼠容易發(fā)展成為自身免疫性疾病[11]。有研究表明，SLE患者外周血 PD-1+CD3+T 細胞和CD19+B 細胞顯著升高，PD-L1+CD19+B 細胞和 PD-L2+CD14+單核細胞顯著升高[12]。付文哲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 在 SLE患者外周血 T、B 細胞上表達上調(diào)，PD-L1 在SLE患者外周血B 細胞和單核細胞上表達上調(diào)。本文研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1 在SLE患者外周血CD4+T 表面表達顯著升高，且陽性組高于陰性組，說明當CD4+T 細胞過度活化時，機體通過其他信號通路產(chǎn)生細胞因子促進PD-L1 表達平衡體內(nèi)細胞免疫，或許與PD-1/PD-L1 參與免疫耐受有關(guān)，與本文發(fā)現(xiàn)陽性組SLE患者血清IFN-γ 表達顯著升高相符。有趣的是，本文發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者CD8+T 細胞和 CD19+B 細胞表面PD-L1分子顯著低于陰性組和健康組。PD-L1 組成性表達在 T、B 細胞淋巴細胞。SLE患者 B 細胞表面PD-L1 表達減少，理論上使PD-L1 /PD-1 通路傳遞給T 細胞的負信號減弱，從而使T 細胞持續(xù)激活，激活的T 細胞可以輔助B 細胞激活，其中可能包括自身反應性B 細胞，后者分泌更多的自身抗體，最終加重 SLE 病情。SLE患者 CD8+T 細胞表面PD-L1 分子表達下調(diào)，可能與SLE患者發(fā)生病毒感染相關(guān)，尤其是巨細胞病毒感染有關(guān)，PD-L1分子表達下調(diào)使CD8+T 細胞活化對病毒進行殺傷，與本課題前期研究一致[14]。

當SLE患者免疫功能紊亂時，輔助性T 淋巴細胞和單核細胞分泌細胞因子，包括Ⅰ型干擾素、腫瘤壞死因子和白介素等一起參與免疫功能的調(diào)節(jié)[15]。人體中血清可溶性分子和細胞膜表面的分子一樣具有相應的生物學功能,和細胞因子一樣參與血液循環(huán)在免疫應答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它們既能夠影響鄰近細胞又能夠和遠端細胞表面的受體相互結(jié)合，從而參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，血清中可溶性PD-L1 在肺癌患者血清中表達升高，并且與肺癌分期，轉(zhuǎn)移和臨床結(jié)局密切相關(guān)[16]，說明在可溶性PD-L1 分子能與腫瘤細胞膜上的PD-1 分子相互作用參與免疫功能調(diào)節(jié)。IFN-γ 作為Toll 樣受體 (TLR) 通路和干擾素刺激通路(STING pathway)的最終產(chǎn)物，能夠反向調(diào)節(jié)T 淋巴細胞，使活化的T 淋巴細胞生存期延長，還能促進記憶性 T 淋巴細胞的分化[17]。IFN-γ 還能誘導 B 淋巴細胞刺激因子的產(chǎn)生，B 淋巴細胞通過細胞受體和免疫球蛋白的結(jié)合而活化和分化，最終產(chǎn)生致病的自身抗體[18]。本文研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，SLE患者PD-L1 血清水平表達顯著下降，而IFN-γ 血清水平顯著升高,且PD-L1 血清水平與IFN-γ呈顯著負相關(guān)。說明IFN-γ 能反向調(diào)控PD-L1 在SLE患者在血清中表達，一同參與免疫功能調(diào)節(jié)。本分還發(fā)現(xiàn)，PD-L1與SLE患者SLEDAI、抗dsDNA 抗體滴度和CRP 呈負相關(guān)，與補體C3 和C4 呈顯著正相關(guān)。說明當SLE患者免疫功能嚴重紊亂時，血清PD-L1 分子表達減少，抗dsDNA 抗體滴度顯著增加，激活干擾素刺激和Toll 樣受體通路,促進輔助性淋巴細胞和單核細胞產(chǎn)生IFN-γ,反向調(diào)節(jié)PD-L1 表達，調(diào)節(jié)SLE患者免疫功能。

總之，本研究研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PD-L1 血清水平與IFN-γ 呈顯著負相關(guān)，與SLE患者疾病活動度呈負相關(guān)，說明PD-1/PD-L1 通路和IFN-γ調(diào)節(jié)免疫功能通路為兩條不同的途徑，一起參與SLE患者疾病的發(fā)展。本研究僅為臨床實驗室數(shù)據(jù)及淋巴細胞表面和可溶性血清細胞因子的檢測及相關(guān)性分析，其具體機制有待進一步研究。