• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    白酒發(fā)酵過程中常見酵母菌扣囊復(fù)膜酵母的研究進(jìn)展*

    2020-06-02 03:21:04王居偉韓培杰王雪薇蔚慧欣梁振榮白逢彥
    廣西科學(xué) 2020年1期

    王居偉,韓培杰,王雪薇,周 森,王 勇,蔚慧欣,梁振榮,白逢彥**

    (1.中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室,北京 100101;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠,北京 101301;4.山西汾酒集團(tuán)股份有限公司,山西汾陽 032205;5.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司,廣西河池 546400)

    0 引言

    扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),又稱擬內(nèi)孢霉,是子囊菌門(Ascomycota)酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)復(fù)膜酵母屬(Saccharomycopsis)的一個種[1-2]。自Wickerham等[3]首次報道利用S.fibuligera水解淀粉以來,已有大量關(guān)于該物種產(chǎn)酶等性狀的研究??勰覐?fù)膜酵母作為優(yōu)勢菌株廣泛存在于淀粉質(zhì)含量高的酒曲(如韓國酒曲Nuruk[4]、泰國酒曲Loog-pang[5]、紅曲和藥曲[6]、我國清香型白酒酒曲[7-9]等)和發(fā)酵前期的酒醅中,且隨著發(fā)酵進(jìn)行數(shù)量迅速減少[4,10]??勰覐?fù)膜酵母還對白酒香型、風(fēng)味形成具有貢獻(xiàn)價值。本文介紹了扣囊復(fù)膜酵母的基本特征、產(chǎn)酶特性及其對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響,為利用組合菌株生產(chǎn)酒精飲料或篩選優(yōu)良菌株用于白酒純種發(fā)酵提供參考依據(jù)。

    1 扣囊復(fù)膜酵母的基本特征

    了解扣囊復(fù)膜酵母的基本特征是運用該菌種進(jìn)行白酒純種發(fā)酵的基礎(chǔ),也是改良白酒生產(chǎn)工藝條件的依據(jù)。對扣囊復(fù)膜酵母基因組信息的解讀,有助于研究其次級代謝產(chǎn)物及調(diào)控規(guī)律,從而提高對酒體、風(fēng)味物質(zhì)的可操控性和穩(wěn)定性。

    扣囊復(fù)膜酵母具有典型的二型性,既存在大量分支狀的有隔假菌絲,又產(chǎn)生酵母狀的芽殖細(xì)胞[11]。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、Mig1(Multicopy Inhibitor of GAL Gene Expression)失活[12],在碳源限制條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)基中葡萄糖≤0.1%)或在培養(yǎng)基中加入線粒體呼吸鏈抑制劑抗霉素A(Antimycin A)[11]時,菌株趨向于酵母態(tài)生長。該酵母有性繁殖產(chǎn)生球形或卵圓形的子囊,呈游離狀或附著于菌絲末端或者側(cè)面。每個子囊可以形成2-4個帽子狀的子囊孢子,并在成熟時釋放[2]。

    目前已公布的基因組分析結(jié)果[11]如表1所示。雜合菌株KJJ81包含兩個亞基因組(A型和B型)。推測由一共同祖先分化為兩個譜系(A型和B型),從A型譜系中分化出菌株KPH12和ATCC36309。菌株KPH12與B型譜系菌株雜交,得到菌株KJJ81的祖先,丟失部分序列后形成菌株KJJ81[11](圖1)。雖然在酒曲中檢測到了B型譜系的菌株,但目前尚未分離到該譜系的純菌株[13]。

    表1Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株基因組信息比較

    Table 1 Genomic information comparison of several strains ofSaccharomycopsisfibuligera

    StrainGenome size (Mb)Proteincoding gene numberScaffold numberGenome sequence identity (%) withKJJ81 subgenome AKJJ81 subgenome BKPH12ATCC36309Mitochondrial genome size (bp)KJJ8138.612 1851467 516KJJ81 subgenome A19.7NA7100.089.099.197.9NAKJJ81 subgenome B18.8NA789.0100.088.690.0NAKPH1219.76 155799.188.6100.098.067 427ATCC3630919.6NA797.990.098.0100.0NA

    Note:NA indicates data not available

    部分只含有A型基因組的菌株和含有A、B型基因組的雜合菌株具有形態(tài)差異:前者的菌落呈白色或微紅色,可通過菌絲吻合(Anastomosis)產(chǎn)生大量包含4個子囊孢子的子囊,而雜合菌株只呈現(xiàn)白色,產(chǎn)生較少的子囊[13]。在高溫和硫限制條件下,雜合菌株表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性[11,13]。

    2 扣囊復(fù)膜酵母的產(chǎn)酶特性

    目前關(guān)于扣囊復(fù)膜酵母的研究多集中于它所分泌的胞外水解酶,包括β-葡糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等。這些酶絕大部分在葡萄糖或硫限制條件下可被誘導(dǎo)表達(dá),且受Mig1負(fù)調(diào)控[11-12]。扣囊復(fù)膜酵母產(chǎn)生的水解酶可以分解大曲、酒醅中的大分子物質(zhì),為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等其他參與釀酒的微生物提供營養(yǎng)。

    2.1 β-葡糖苷酶

    纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)[14]。纖維素先經(jīng)內(nèi)/外切葡聚糖酶降解為纖維二糖和寡糖,再由β-葡糖苷酶降解為葡萄糖。β-葡糖苷酶為限速酶,可以解除纖維二糖對內(nèi)/外切葡聚糖酶的抑制,從而決定纖維素的降解速度和程度[15-16]。

    目前已從扣囊復(fù)膜酵母中分離得到兩種β-葡糖苷酶:BGL1和BGL2,其蛋白序列高度相似(83%),在不同pH值、溫度及熱變性條件下具有相近的酶學(xué)特性,但BGL1可以更有效地降解纖維二糖[17]。BGL1可被Cr6+、Mn2+和Fe2+激活,其中Cr6+的激活效果最顯著[18]。此外,還在菌株KPH12、KJJ81和ATCC36309的基因組中發(fā)現(xiàn)與BGL1基因具有一定同源性(55%)的BGL3,以及編碼裂殖酵母β-葡糖苷酶的同系物基因BGL4,但其功能尚未得到驗證[11]。

    將扣囊復(fù)膜酵母的β-葡糖苷酶基因?qū)脶劸平湍窼.cerevisiae菌株中可用于生產(chǎn)生物乙醇,包括將其整合到基因組中(如27rDNA區(qū)域)[19]或通過外源載體表達(dá)該基因。在優(yōu)化外源載體表達(dá)條件時,發(fā)現(xiàn)利用組成型啟動子(Actin Promoter)表達(dá)要優(yōu)于誘導(dǎo)型啟動子(Galactose-Inducible Promoter)[20]。分泌到胞外的β-葡糖苷酶在水解速率和乙醇產(chǎn)量上均優(yōu)于胞內(nèi)β-葡糖苷酶[21]。此外,乙醇產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化菌株的遺傳背景也有相關(guān)性[20]。

    *在亞基因組B譜系中某些非必需基因的缺失可能發(fā)生在雜交事件之后

    *Some non-essential genes in the subgenome B lineage could occur after a hybridization event

    圖1 基于基因組序列分析推測的S.fibuligera雜合二倍體菌株KJJ81形成過程(仿自Choo等[11])

    Fig.1 Hybrid formation ofS.fibuligeraKJJ81 based on genome sequence analysis speculation (modified from Choo et al.[11])

    2.2 酸性蛋白酶

    酸性蛋白酶,也稱為天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23),具有以天冬氨酸位點為催化中心的兩個活性區(qū)域,特征序列分別為N端的Asp32-Thr-Gly-Ser和C端的Asp215-Thr-Gly-Ser/Thr[22]。酸性蛋白酶在白酒發(fā)酵中的作用包括:(1)溶解顆粒狀原料并從顆粒上釋放被吸附的α淀粉酶[23-24];(2)分解原料、死菌菌體蛋白生成的氨基酸,供釀酒酵母攝取利用,促進(jìn)酵母菌生長繁殖[23-24];(3)酵母中氨基酸合成的起始物多來自于糖代謝途徑中間產(chǎn)物,吸收利用外源氨基酸可減少自身氨基酸合成代謝,使底物用于酒精發(fā)酵,提高出酒率[24-26];(4)氨基酸是白酒中高級醇的主要來源,而高級醇及其派生物是白酒中重要的呈香物質(zhì)[24]。

    扣囊復(fù)膜酵母中的酸性蛋白酶多為分泌型(Secreted Aspartyl Proteases,SAP),在N端有作為分泌信號的疏水片段,在基因組中常含有多個拷貝[11,27]??勰覐?fù)膜酵母中酸性蛋白酶的活性下降會增加海藻糖的積累量,提高淀粉酶的活性和穩(wěn)定性[27]。

    扣囊復(fù)膜酵母中酸性蛋白酶包括兩類,一類為天冬氨酸蛋白酶PEP1(Aspartic Protease PEP1)類同源物[28-29],不含糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定基序(Anchor Motif),這類酶在葡萄糖和硫限制條件下被誘導(dǎo)表達(dá)[11];另一類為酵母天冬氨酸蛋白酶Yapsin (Yeast Aspartic Protease)類同源物,在C端具有GPI錨定基序,幫助其定位于細(xì)胞壁表面,這類酶為組成型表達(dá)[11,30]。

    除了在白酒釀造過程中發(fā)揮作用,扣囊復(fù)膜酵母的酸性蛋白酶還可作為凝乳酶(Rennin),在奶酪制作等方面具有巨大潛力。凝乳酶可特異性水解牛奶中κ-酪蛋白內(nèi)的Phe105-Met106間肽鍵,破壞酪蛋白膠束,從而使牛奶絮凝。Yu等[31]在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)菌株P(guān)o1h中克隆表達(dá)了S.fibuligera菌株A11的蛋白酶基因APG,篩選得到具有最大水解圈的轉(zhuǎn)化子71;從轉(zhuǎn)化子71培養(yǎng)基上清中純化得到重組酶,其分子量約為94.8 kDa,最適pH值為3.5,最適溫度為33℃;Zn2+可作為激活劑,而部分離子(Hg2+、Fe2+、Fe3+和Mg2+)、EDTA、EGTA、碘乙酸和胃蛋白酶抑制劑會抑制其酶活[31]。由于表面展示的酸性蛋白酶無需純化,可直接應(yīng)用于凝乳過程,節(jié)省了成本。Yu等[30]將APG基因克隆至表面展示載體(Surface Display Vector)pINA1317-YlCWP110并在Po1h中表達(dá),發(fā)現(xiàn)重組蛋白的His標(biāo)簽會降低蛋白酶及凝乳酶活性。分離自海洋魚類腸道的Y.lipolytica菌株SWJ-1b具有用作單細(xì)胞蛋白的潛力,為提高其凝乳酶活性,Yu等[32]先將原有的蛋白酶基因AXP敲除,以防止其降解外源蛋白,隨后克隆表達(dá)了A11的酸性蛋白酶基因AP1,所得轉(zhuǎn)化子43酶活力(46.7 U/mg)高于此前得到的菌株P(guān)o1h轉(zhuǎn)化子71的酶活力(26.3 U/mg);轉(zhuǎn)化子43中粗蛋白含量為43.53% (W∶W) ,略低于原始菌株SWJ-1b(45.63%),但其凝乳酶活性優(yōu)于原始菌株SWJ-1b,因此可用于生產(chǎn)凝乳酶,或作為食品工業(yè)中相應(yīng)蛋白質(zhì)的來源。

    2.3 淀粉酶

    淀粉是由直鏈淀粉(由α-1,4糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)和支鏈淀粉(分別由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)組成,可被淀粉酶降解為葡萄糖、寡糖和糊精[33]。目前對扣囊復(fù)膜酵母中淀粉酶的研究多集中于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和生淀粉糖化酶。

    2.3.1 α-淀粉酶

    α-淀粉酶可催化水解淀粉中的α-1,4糖苷鍵,與其他淀粉酶協(xié)同作用,可將淀粉分解為α-極限糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖[34]。

    目前已報道的扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶包括ALP1[35-36]、Sfamy KZ[37]、Sfamy R64[38]和SFA1[39],其蛋白序列長度約為494個氨基酸,最適pH值為5.0-6.0,最適溫度為40-50℃;其蛋白N端與催化活性有關(guān),C端與熱穩(wěn)定性及結(jié)合淀粉的能力有關(guān)[38]??勰覐?fù)膜酵母α-淀粉酶可少量降解生淀粉并具有底物濃度依賴性,但不能結(jié)合在淀粉顆粒上[37-38]。

    扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶的C端缺少由芳香族氨基酸組成的表面結(jié)合位點[40],對其進(jìn)行模擬改造(多個位點突變:S383Y/S386W/N421G/S278N/A281K/Q384K/K398R和引入環(huán)G400-S401)可提高其吸附淀粉的能力[40-41]。此外,利用化學(xué)修飾和點突變(S336C/S437C)也可提高α-淀粉酶的穩(wěn)定性,保護(hù)輔助因子Ca2+,提高對胰蛋白酶的抗性[42-43]。在工業(yè)應(yīng)用中,將扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶基因與其他基因(S.cerevisiae谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1[44],疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)葡糖淀粉酶基因TLG1[45])組合導(dǎo)入釀酒酵母中,可用以生產(chǎn)啤酒或生物乙醇發(fā)酵。

    2.3.2 葡糖淀粉酶

    葡糖淀粉酶可以從淀粉分子和α-1,4糖苷鍵連接的麥芽寡糖非還原末端逐步水解釋放β-葡萄糖[46],也可以低效水解α-1,6糖苷鍵[47]。

    目前已報道的扣囊復(fù)膜酵母葡糖淀粉酶包括GLU、GLA、GLL、GLM(表2),此外也在部分菌株基因組中發(fā)現(xiàn)與白色念珠菌葡糖淀粉酶基因GAM1同源的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)[11]。

    表2Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株的葡糖淀粉酶特性

    Table 2 Enzymatic properties of glucoamylase from severalSaccharomycopsisfibuligerastrains

    EnzymeStrainsOptimal pHOptimal temperature (℃)Km (mmol/L) maltooligosacharideMaltoseMaltotrioseMaltotetraoseMaltoheptaoseRaw starch digestionAmino acids of mature proteinAmino acids of signal peptideVariant sites in the protein moleculeReferencesGLU HUT72125.8501.970.40.0870.053No49227E27,N46,E166,A377,A410,Y461,G467[4853]GLA KZ5.0-6.240-501.820.330.0810.05No49227D27,D46,K166,V377,G410,N461,S467[46,4951,5354]GLL R645.6-6.450NANANANANo492NAD27,D46,E166,V377,A410,Y461,G467[4950]GLMIFO 0111 4.8-5.040NANANANAYes48926NA[49,5558]

    Note:NA,data not available;Different colors indicate that variant sites in GLL are the combination of some variant sites in GLU and GLA

    將GLU和GLA基因?qū)脶劸平湍副磉_(dá), GLU酶活力高于GLA酶活力[46,59]。兩者信號肽及N端的變異對酶的表達(dá)水平?jīng)]有影響,而C端的變異會同時影響酶活力、底物特異性、最適溫度和最適pH值。糖基化程度不同會導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不均一,影響熱穩(wěn)定性以及熱變性后的復(fù)性能力,但不影響酶活力[50,59]。將GLU中C端保守活性區(qū)域S5中的Gly467替換為GLA中的Ser,會使其與底物的親和性接近于GLA,酶的穩(wěn)定性降低,但與底物類似物阿卡波糖的結(jié)合能力提高[50]。

    菌株IFO 0111產(chǎn)生的單一淀粉酶GLM是目前唯一報道的,可以降解生淀粉的扣囊復(fù)膜酵母葡糖淀粉酶[56-57],而GLU、GLA和GLL只能較弱地吸附但不能降解生淀粉[51]。這是由于GLM中含有更多的色氨酸和組氨酸,其中的芳香族氨基酸(如色氨酸)可以通過疏水堆積作用與底物的糖環(huán)結(jié)合[51]。GLM可水解淀粉、糖原和極限糊精等多種多糖產(chǎn)生葡萄糖。GLM具有很高的脫支活性(Debranching Activity),對含支鏈底物(如支鏈淀粉、糖原和極限糊精)的降解程度很高,但不能徹底降解直鏈淀粉[60],其降解生淀粉的最適pH值為4.5,而降解可溶性淀粉的最適pH值為5.5。當(dāng)pH值為2.0-7.6時,GLM可以完全吸附在生淀粉上;該酶催化生淀粉的活性會被淀粉酶抑制劑阻遏,但其對淀粉的吸附性不受影響[57]。

    大部分葡糖淀粉酶是由淀粉催化區(qū)域和結(jié)合區(qū)域通過O-糖基化區(qū)域連接而成[61],但GLU和GLM都缺少獨立的淀粉結(jié)合區(qū)域,它們在酶的活性位點附近有一些與生淀粉結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基(GLM/GLU:D122/K121、H201/Y200、T204/S203、S205/T204、Q276/D277、S278/N282、S139/A138、E60/N60、V351/D354、T353/S356)[51]。在GLU表面距催化位點25 ?處有另一個淀粉結(jié)合位點,該位點處的Arg15、His447、Asp450、Thr462、Tyr464和Ser465具有重要作用。將其中部分氨基酸(Arg15Ala、His447Ala、Thr462Ala和His447Ala/Asp450Ala)突變后,GLU不能再與生淀粉結(jié)合。在GLM中部分氨基酸也很保守(Arg15、His444、Asp447、Thr459和Phe461)[47],將GLM的His444和Asp447突變?yōu)锳la后,GLM結(jié)合生淀粉的能力下降,說明這一位點對結(jié)合生淀粉具有重要作用[62]。

    3 扣囊復(fù)膜酵母對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

    扣囊復(fù)膜酵母的代謝物對白酒香型、風(fēng)味的形成具有一定作用,其代謝譜與菌株[63-65]、酶活力[66]、培養(yǎng)基成分[67]及培養(yǎng)時間[67]有關(guān)。當(dāng)碳源為葡萄糖時,主要的揮發(fā)性代謝物包括2-苯乙醇、2-乙酸苯乙酯和苯乙酸乙酯,這些均為苯丙氨酸衍生物,呈果香或花香;主要的非揮發(fā)性代謝物包括3種碳水化合物(甘露糖、阿拉伯醇、甘露醇)、4種脂肪酸(丙酸、軟脂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸)、2種有機酸(草酸、琥珀酸)和8種氨基酸(異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸)[67]。當(dāng)培養(yǎng)基為高粱時,代謝物包括9種酯類、5種內(nèi)酯類、7種醇類、9種萘酚類、7種酸類和4種醛酮類化合物,其中6種化合物(苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲基丁酸和苯乙酸)為牛欄山二鍋頭白酒的重要生香成分[63]。

    在米根霉、釀酒酵母中加入扣囊復(fù)膜酵母混合發(fā)酵可提升酒中總酸和氨基態(tài)氮的含量,同時大幅減少酒中的有害醇(甲醇、異丁醇、異戊醇)和總高級醇的含量,從而改善酒的品質(zhì)。推測其原因,可能是由于扣囊復(fù)膜酵母菌株無法將丙酮酸高效轉(zhuǎn)化為乙醇,轉(zhuǎn)而生成乳酸和乙酸等,間接抑制了高級醇的生成。除丁酸乙酯,其他酯類(乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯)和總低級酯在混合發(fā)酵中均有增加,使酒的風(fēng)味得到改善[66]。

    4 展望

    目前關(guān)于扣囊復(fù)膜酵母中的主要水解酶系和代謝譜已有大量研究,全基因組的公布也為進(jìn)一步開發(fā)利用該物種提供了參考。鑒于扣囊復(fù)膜酵母的功能特性,未來還可通過對組學(xué)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析和分子生物學(xué)研究,闡明其在白酒發(fā)酵過程中的代謝通路調(diào)控,以及與其他白酒微生物的互作關(guān)系。此外,還需確定不同風(fēng)味白酒釀造中適應(yīng)不同工藝和發(fā)酵條件的扣囊復(fù)膜酵母菌株遺傳多樣性及其在生理、功能上的差異,從而為實際生產(chǎn)中篩選優(yōu)良菌株,改良白酒品質(zhì)提供參考依據(jù)。

    简卡轻食公司| 亚洲第一电影网av| 三级毛片av免费| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99在线视频只有这里精品首页| av视频在线观看入口| 午夜亚洲福利在线播放| АⅤ资源中文在线天堂| 美女大奶头视频| 成人国产一区最新在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 色综合婷婷激情| 免费观看精品视频网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美中文日本在线观看视频| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久99热这里只有精品18| 大型黄色视频在线免费观看| 久久香蕉精品热| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线播放国产精品三级| 一级av片app| 嫩草影院入口| 听说在线观看完整版免费高清| 香蕉av资源在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲精品在线美女| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美在线乱码| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产老妇女一区| 国产高清视频在线播放一区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 激情在线观看视频在线高清| 特级一级黄色大片| 亚洲在线观看片| 精品久久久久久成人av| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| aaaaa片日本免费| 国产成人影院久久av| 丰满乱子伦码专区| 久久99热这里只有精品18| 午夜免费成人在线视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美乱色亚洲激情| 精品久久久久久久久久免费视频| 91麻豆av在线| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久国内视频| 岛国在线免费视频观看| 深爱激情五月婷婷| 少妇的逼好多水| 亚洲18禁久久av| 99热只有精品国产| 国产欧美日韩一区二区三| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 国产老妇女一区| 国产乱人伦免费视频| 国产熟女xx| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 内地一区二区视频在线| 日本三级黄在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产91精品成人一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久九九精品影院| 国产精华一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 男女视频在线观看网站免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 一进一出好大好爽视频| 国产三级黄色录像| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产真实伦视频高清在线观看 | 波多野结衣高清无吗| 免费看a级黄色片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩成人在线观看一区二区三区| 少妇丰满av| 亚洲自偷自拍三级| 天堂√8在线中文| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲,欧美精品.| АⅤ资源中文在线天堂| 露出奶头的视频| 国产黄色小视频在线观看| 69av精品久久久久久| 久久久久九九精品影院| 很黄的视频免费| 中出人妻视频一区二区| 一级av片app| 在线播放国产精品三级| 久久久久精品国产欧美久久久| 99热这里只有是精品50| 国产成人a区在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲人成电影免费在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 毛片女人毛片| 欧美乱妇无乱码| 99在线视频只有这里精品首页| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品伦人一区二区| 九色国产91popny在线| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣巨乳人妻| 一个人看视频在线观看www免费| 看十八女毛片水多多多| 熟女电影av网| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 草草在线视频免费看| 亚洲第一电影网av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 51国产日韩欧美| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲成av人片免费观看| 久久九九热精品免费| 午夜福利视频1000在线观看| 一本久久中文字幕| 十八禁人妻一区二区| 国产成人影院久久av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本一二三区视频观看| 俺也久久电影网| 午夜老司机福利剧场| 桃红色精品国产亚洲av| 嫩草影院入口| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 51午夜福利影视在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲性夜色夜夜综合| 99国产精品一区二区蜜桃av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美免费精品| 69人妻影院| 丝袜美腿在线中文| 97热精品久久久久久| 国产精华一区二区三区| 国产淫片久久久久久久久 | 日韩 亚洲 欧美在线| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷丁香在线五月| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜视频国产福利| 韩国av一区二区三区四区| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产精品合色在线| 无遮挡黄片免费观看| 色哟哟·www| 在线观看午夜福利视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产成人av教育| 天天躁日日操中文字幕| 禁无遮挡网站| 免费看日本二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲五月天丁香| 日韩亚洲欧美综合| 国产成人av教育| 欧美成人免费av一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲午夜理论影院| 在线a可以看的网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清视频在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜激情福利司机影院| 亚洲人成网站在线播| 亚洲天堂国产精品一区在线| av专区在线播放| 麻豆成人av在线观看| 精品人妻1区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 十八禁网站免费在线| 51午夜福利影视在线观看| 免费观看的影片在线观看| 51国产日韩欧美| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人欧美大片| 欧美+日韩+精品| 欧美区成人在线视频| 国产野战对白在线观看| www.色视频.com| 国产精品三级大全| 岛国在线免费视频观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 一a级毛片在线观看| 我的老师免费观看完整版| 久久中文看片网| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 最新在线观看一区二区三区| 看免费av毛片| 午夜两性在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 白带黄色成豆腐渣| 免费看a级黄色片| 色哟哟·www| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美潮喷喷水| 搞女人的毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本 欧美在线| 在线看三级毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲,欧美,日韩| 一进一出抽搐gif免费好疼| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 韩国av一区二区三区四区| 午夜影院日韩av| 国产一区二区在线av高清观看| 日本a在线网址| 久久久国产成人免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 最近最新中文字幕大全电影3| 中文字幕av在线有码专区| 免费无遮挡裸体视频| 国产爱豆传媒在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 哪里可以看免费的av片| 精品久久久久久久末码| 免费在线观看亚洲国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲,欧美,日韩| 国产免费一级a男人的天堂| 国产不卡一卡二| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美在线一区亚洲| 可以在线观看的亚洲视频| 国产久久久一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产黄片美女视频| 最好的美女福利视频网| 欧美黑人欧美精品刺激| 一区二区三区四区激情视频 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 一进一出抽搐动态| 午夜久久久久精精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| ponron亚洲| 免费av毛片视频| 亚洲av一区综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男女那种视频在线观看| 黄色一级大片看看| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久久久久黄片| 最近最新免费中文字幕在线| 一本精品99久久精品77| 国产视频一区二区在线看| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产黄色小视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品456在线播放app | 成人精品一区二区免费| 亚洲成人久久性| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99久久精品国产亚洲精品| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲专区国产一区二区| av国产免费在线观看| 亚洲无线在线观看| 亚洲国产色片| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 一区二区三区激情视频| 色吧在线观看| 十八禁人妻一区二区| 久久伊人香网站| 一个人看的www免费观看视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 超碰av人人做人人爽久久| 免费在线观看成人毛片| 精品国内亚洲2022精品成人| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品乱码久久久久久99久播| 天天躁日日操中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲在线自拍视频| 一区二区三区激情视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人无遮挡网站| 色尼玛亚洲综合影院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 色哟哟·www| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人看人人澡| 日韩欧美 国产精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| а√天堂www在线а√下载| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| a级毛片免费高清观看在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲 国产 在线| 欧美性感艳星| 夜夜夜夜夜久久久久| 搞女人的毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人欧美在线观看| 小说图片视频综合网站| 90打野战视频偷拍视频| 一级av片app| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 制服丝袜大香蕉在线| 99久国产av精品| 少妇高潮的动态图| 日本 av在线| 十八禁人妻一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| a级毛片免费高清观看在线播放| 成年免费大片在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 国产91精品成人一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲成av人片免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 香蕉av资源在线| 日韩亚洲欧美综合| 午夜日韩欧美国产| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成年人黄色毛片网站| 免费av观看视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久午夜福利片| 怎么达到女性高潮| 日韩中字成人| 国产欧美日韩一区二区精品| 99久久精品一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一区二区三区免费毛片| 丁香六月欧美| 午夜免费成人在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 最后的刺客免费高清国语| 波多野结衣巨乳人妻| 一区福利在线观看| 久久九九热精品免费| 在线播放无遮挡| 欧美午夜高清在线| 毛片女人毛片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 最新中文字幕久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| av中文乱码字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 脱女人内裤的视频| 欧美bdsm另类| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 免费看美女性在线毛片视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产欧美人成| 级片在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av第一区精品v没综合| 高清在线国产一区| 此物有八面人人有两片| 91久久精品国产一区二区成人| 波多野结衣巨乳人妻| 国产欧美日韩一区二区三| 女人被狂操c到高潮| 国产视频一区二区在线看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产三级黄色录像| 婷婷丁香在线五月| 精品一区二区三区人妻视频| 深爱激情五月婷婷| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线观看av片永久免费下载| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品久久久久久久久久久久久| 国产乱人视频| 51午夜福利影视在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 身体一侧抽搐| 天美传媒精品一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜老司机福利剧场| 99久久99久久久精品蜜桃| 熟女人妻精品中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲综合色惰| 亚洲一区高清亚洲精品| 熟女电影av网| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品一区二区性色av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本三级黄在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一进一出抽搐动态| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久精品吃奶| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲自拍偷在线| 亚洲欧美清纯卡通| 色5月婷婷丁香| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美色欧美亚洲另类二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 淫秽高清视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 波多野结衣高清无吗| 欧美成人a在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 搡老岳熟女国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产乱人伦免费视频| 国产成人福利小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 看片在线看免费视频| 99久久精品热视频| x7x7x7水蜜桃| 国产精品亚洲一级av第二区| 乱人视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久人人精品亚洲av| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美乱色亚洲激情| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一区二区三区视频了| 欧美成人a在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 有码 亚洲区| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 悠悠久久av| 国产精华一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老女人水多毛片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产美女午夜福利| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 丁香欧美五月| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品久久久久久久电影| 51午夜福利影视在线观看| 成人精品一区二区免费| 88av欧美| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 中文字幕av成人在线电影| 国产真实乱freesex| h日本视频在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产探花在线观看一区二区| 在线观看一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲人成网站高清观看| 久久这里只有精品中国| 在线看三级毛片| 免费看a级黄色片| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 淫秽高清视频在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩欧美三级三区| 日本在线视频免费播放| 久久99热这里只有精品18| 色尼玛亚洲综合影院| 少妇丰满av| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美又色又爽又黄视频| 成人性生交大片免费视频hd| 不卡一级毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜精品久久久久久毛片777| 悠悠久久av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品熟女少妇八av免费久了| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 成人国产一区最新在线观看| 在现免费观看毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 天堂影院成人在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲欧美激情综合另类| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 十八禁人妻一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 两个人视频免费观看高清| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av成人精品一区久久| 精品乱码久久久久久99久播| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 国产综合懂色| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 脱女人内裤的视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 有码 亚洲区| 国产精品人妻久久久久久| 黄色视频,在线免费观看| 91在线观看av| 极品教师在线免费播放| 韩国av一区二区三区四区| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 夜夜爽天天搞| 欧美三级亚洲精品| 日韩亚洲欧美综合| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美午夜高清在线| 日韩欧美国产在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩欧美国产在线观看| 宅男免费午夜| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一二三四社区在线视频社区8| 天堂网av新在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜视频国产福利| 我要搜黄色片| 国产黄片美女视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品在线美女| 日韩亚洲欧美综合| 日韩欧美国产一区二区入口| 又爽又黄无遮挡网站| 一区福利在线观看| 成人亚洲精品av一区二区|