白酒發(fā)酵過程中常見酵母菌扣囊復(fù)膜酵母的研究進展*

王居偉，韓培杰，王雪薇，周 森，王 勇，蔚慧欣，梁振榮，白逢彥**

(1.中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室，北京 100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301；4.山西汾酒集團股份有限公司，山西汾陽 032205；5.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司，廣西河池 546400)

0 引言

扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)，又稱擬內(nèi)孢霉，是子囊菌門(Ascomycota)酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)復(fù)膜酵母屬(Saccharomycopsis)的一個種[1-2]。自Wickerham等[3]首次報道利用S.fibuligera水解淀粉以來，已有大量關(guān)于該物種產(chǎn)酶等性狀的研究?？勰覐?fù)膜酵母作為優(yōu)勢菌株廣泛存在于淀粉質(zhì)含量高的酒曲(如韓國酒曲Nuruk[4]、泰國酒曲Loog-pang[5]、紅曲和藥曲[6]、我國清香型白酒酒曲[7-9]等)和發(fā)酵前期的酒醅中，且隨著發(fā)酵進行數(shù)量迅速減少[4,10]。扣囊復(fù)膜酵母還對白酒香型、風(fēng)味形成具有貢獻價值。本文介紹了扣囊復(fù)膜酵母的基本特征、產(chǎn)酶特性及其對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響，為利用組合菌株生產(chǎn)酒精飲料或篩選優(yōu)良菌株用于白酒純種發(fā)酵提供參考依據(jù)。

1 扣囊復(fù)膜酵母的基本特征

了解扣囊復(fù)膜酵母的基本特征是運用該菌種進行白酒純種發(fā)酵的基礎(chǔ)，也是改良白酒生產(chǎn)工藝條件的依據(jù)。對扣囊復(fù)膜酵母基因組信息的解讀，有助于研究其次級代謝產(chǎn)物及調(diào)控規(guī)律，從而提高對酒體、風(fēng)味物質(zhì)的可操控性和穩(wěn)定性。

扣囊復(fù)膜酵母具有典型的二型性，既存在大量分支狀的有隔假菌絲，又產(chǎn)生酵母狀的芽殖細胞[11]。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、Mig1(Multicopy Inhibitor of GAL Gene Expression)失活[12]，在碳源限制條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)基中葡萄糖≤0.1%)或在培養(yǎng)基中加入線粒體呼吸鏈抑制劑抗霉素A(Antimycin A)[11]時，菌株趨向于酵母態(tài)生長。該酵母有性繁殖產(chǎn)生球形或卵圓形的子囊，呈游離狀或附著于菌絲末端或者側(cè)面。每個子囊可以形成2-4個帽子狀的子囊孢子，并在成熟時釋放[2]。

目前已公布的基因組分析結(jié)果[11]如表1所示。雜合菌株KJJ81包含兩個亞基因組(A型和B型)。推測由一共同祖先分化為兩個譜系(A型和B型)，從A型譜系中分化出菌株KPH12和ATCC36309。菌株KPH12與B型譜系菌株雜交，得到菌株KJJ81的祖先，丟失部分序列后形成菌株KJJ81[11](圖1)。雖然在酒曲中檢測到了B型譜系的菌株，但目前尚未分離到該譜系的純菌株[13]。

表1Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株基因組信息比較

Table 1 Genomic information comparison of several strains ofSaccharomycopsisfibuligera

StrainGenome size (Mb)Proteincoding gene numberScaffold numberGenome sequence identity (%) withKJJ81 subgenome AKJJ81 subgenome BKPH12ATCC36309Mitochondrial genome size (bp)KJJ8138.612 1851467 516KJJ81 subgenome A19.7NA7100.089.099.197.9NAKJJ81 subgenome B18.8NA789.0100.088.690.0NAKPH1219.76 155799.188.6100.098.067 427ATCC3630919.6NA797.990.098.0100.0NA

Note：NA indicates data not available

部分只含有A型基因組的菌株和含有A、B型基因組的雜合菌株具有形態(tài)差異：前者的菌落呈白色或微紅色，可通過菌絲吻合(Anastomosis)產(chǎn)生大量包含4個子囊孢子的子囊，而雜合菌株只呈現(xiàn)白色，產(chǎn)生較少的子囊[13]。在高溫和硫限制條件下，雜合菌株表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性[11,13]。

2 扣囊復(fù)膜酵母的產(chǎn)酶特性

目前關(guān)于扣囊復(fù)膜酵母的研究多集中于它所分泌的胞外水解酶，包括β-葡糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等。這些酶絕大部分在葡萄糖或硫限制條件下可被誘導(dǎo)表達，且受Mig1負調(diào)控[11-12]。扣囊復(fù)膜酵母產(chǎn)生的水解酶可以分解大曲、酒醅中的大分子物質(zhì)，為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等其他參與釀酒的微生物提供營養(yǎng)。

2.1 β-葡糖苷酶

纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)[14]。纖維素先經(jīng)內(nèi)/外切葡聚糖酶降解為纖維二糖和寡糖，再由β-葡糖苷酶降解為葡萄糖。β-葡糖苷酶為限速酶，可以解除纖維二糖對內(nèi)/外切葡聚糖酶的抑制，從而決定纖維素的降解速度和程度[15-16]。

目前已從扣囊復(fù)膜酵母中分離得到兩種β-葡糖苷酶：BGL1和BGL2，其蛋白序列高度相似(83%)，在不同pH值、溫度及熱變性條件下具有相近的酶學(xué)特性，但BGL1可以更有效地降解纖維二糖[17]。BGL1可被Cr6+、Mn2+和Fe2+激活，其中Cr6+的激活效果最顯著[18]。此外，還在菌株KPH12、KJJ81和ATCC36309的基因組中發(fā)現(xiàn)與BGL1基因具有一定同源性(55%)的BGL3，以及編碼裂殖酵母β-葡糖苷酶的同系物基因BGL4，但其功能尚未得到驗證[11]。

將扣囊復(fù)膜酵母的β-葡糖苷酶基因?qū)脶劸平湍窼.cerevisiae菌株中可用于生產(chǎn)生物乙醇，包括將其整合到基因組中(如27rDNA區(qū)域)[19]或通過外源載體表達該基因。在優(yōu)化外源載體表達條件時，發(fā)現(xiàn)利用組成型啟動子(Actin Promoter)表達要優(yōu)于誘導(dǎo)型啟動子(Galactose-Inducible Promoter)[20]。分泌到胞外的β-葡糖苷酶在水解速率和乙醇產(chǎn)量上均優(yōu)于胞內(nèi)β-葡糖苷酶[21]。此外，乙醇產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化菌株的遺傳背景也有相關(guān)性[20]。

*在亞基因組B譜系中某些非必需基因的缺失可能發(fā)生在雜交事件之后

*Some non-essential genes in the subgenome B lineage could occur after a hybridization event

圖1 基于基因組序列分析推測的S.fibuligera雜合二倍體菌株KJJ81形成過程(仿自Choo等[11])

Fig.1 Hybrid formation ofS.fibuligeraKJJ81 based on genome sequence analysis speculation (modified from Choo et al.[11])

2.2 酸性蛋白酶

酸性蛋白酶，也稱為天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)，具有以天冬氨酸位點為催化中心的兩個活性區(qū)域，特征序列分別為N端的Asp32-Thr-Gly-Ser和C端的Asp215-Thr-Gly-Ser/Thr[22]。酸性蛋白酶在白酒發(fā)酵中的作用包括：(1)溶解顆粒狀原料并從顆粒上釋放被吸附的α淀粉酶[23-24]；(2)分解原料、死菌菌體蛋白生成的氨基酸,供釀酒酵母攝取利用，促進酵母菌生長繁殖[23-24]；(3)酵母中氨基酸合成的起始物多來自于糖代謝途徑中間產(chǎn)物，吸收利用外源氨基酸可減少自身氨基酸合成代謝，使底物用于酒精發(fā)酵，提高出酒率[24-26]；(4)氨基酸是白酒中高級醇的主要來源，而高級醇及其派生物是白酒中重要的呈香物質(zhì)[24]。

扣囊復(fù)膜酵母中的酸性蛋白酶多為分泌型(Secreted Aspartyl Proteases，SAP)，在N端有作為分泌信號的疏水片段，在基因組中常含有多個拷貝[11,27]?？勰覐?fù)膜酵母中酸性蛋白酶的活性下降會增加海藻糖的積累量，提高淀粉酶的活性和穩(wěn)定性[27]。

扣囊復(fù)膜酵母中酸性蛋白酶包括兩類，一類為天冬氨酸蛋白酶PEP1(Aspartic Protease PEP1)類同源物[28-29]，不含糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定基序(Anchor Motif)，這類酶在葡萄糖和硫限制條件下被誘導(dǎo)表達[11]；另一類為酵母天冬氨酸蛋白酶Yapsin (Yeast Aspartic Protease)類同源物，在C端具有GPI錨定基序，幫助其定位于細胞壁表面，這類酶為組成型表達[11,30]。

除了在白酒釀造過程中發(fā)揮作用，扣囊復(fù)膜酵母的酸性蛋白酶還可作為凝乳酶(Rennin)，在奶酪制作等方面具有巨大潛力。凝乳酶可特異性水解牛奶中κ-酪蛋白內(nèi)的Phe105-Met106間肽鍵，破壞酪蛋白膠束，從而使牛奶絮凝。Yu等[31]在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)菌株P(guān)o1h中克隆表達了S.fibuligera菌株A11的蛋白酶基因APG，篩選得到具有最大水解圈的轉(zhuǎn)化子71；從轉(zhuǎn)化子71培養(yǎng)基上清中純化得到重組酶，其分子量約為94.8 kDa，最適pH值為3.5，最適溫度為33℃；Zn2+可作為激活劑，而部分離子(Hg2+、Fe2+、Fe3+和Mg2+)、EDTA、EGTA、碘乙酸和胃蛋白酶抑制劑會抑制其酶活[31]。由于表面展示的酸性蛋白酶無需純化，可直接應(yīng)用于凝乳過程，節(jié)省了成本。Yu等[30]將APG基因克隆至表面展示載體(Surface Display Vector)pINA1317-YlCWP110并在Po1h中表達，發(fā)現(xiàn)重組蛋白的His標(biāo)簽會降低蛋白酶及凝乳酶活性。分離自海洋魚類腸道的Y.lipolytica菌株SWJ-1b具有用作單細胞蛋白的潛力，為提高其凝乳酶活性，Yu等[32]先將原有的蛋白酶基因AXP敲除，以防止其降解外源蛋白，隨后克隆表達了A11的酸性蛋白酶基因AP1，所得轉(zhuǎn)化子43酶活力(46.7 U/mg)高于此前得到的菌株P(guān)o1h轉(zhuǎn)化子71的酶活力(26.3 U/mg)；轉(zhuǎn)化子43中粗蛋白含量為43.53% (W∶W) ，略低于原始菌株SWJ-1b(45.63%)，但其凝乳酶活性優(yōu)于原始菌株SWJ-1b，因此可用于生產(chǎn)凝乳酶，或作為食品工業(yè)中相應(yīng)蛋白質(zhì)的來源。

2.3 淀粉酶

淀粉是由直鏈淀粉(由α-1,4糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)和支鏈淀粉(分別由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)組成，可被淀粉酶降解為葡萄糖、寡糖和糊精[33]。目前對扣囊復(fù)膜酵母中淀粉酶的研究多集中于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和生淀粉糖化酶。

2.3.1 α-淀粉酶

α-淀粉酶可催化水解淀粉中的α-1,4糖苷鍵，與其他淀粉酶協(xié)同作用，可將淀粉分解為α-極限糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖[34]。

目前已報道的扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶包括ALP1[35-36]、Sfamy KZ[37]、Sfamy R64[38]和SFA1[39]，其蛋白序列長度約為494個氨基酸，最適pH值為5.0-6.0，最適溫度為40-50℃;其蛋白N端與催化活性有關(guān)，C端與熱穩(wěn)定性及結(jié)合淀粉的能力有關(guān)[38]。扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶可少量降解生淀粉并具有底物濃度依賴性，但不能結(jié)合在淀粉顆粒上[37-38]。

扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶的C端缺少由芳香族氨基酸組成的表面結(jié)合位點[40]，對其進行模擬改造(多個位點突變：S383Y/S386W/N421G/S278N/A281K/Q384K/K398R和引入環(huán)G400-S401)可提高其吸附淀粉的能力[40-41]。此外，利用化學(xué)修飾和點突變(S336C/S437C)也可提高α-淀粉酶的穩(wěn)定性，保護輔助因子Ca2+，提高對胰蛋白酶的抗性[42-43]。在工業(yè)應(yīng)用中，將扣囊復(fù)膜酵母α-淀粉酶基因與其他基因(S.cerevisiae谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1[44]，疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)葡糖淀粉酶基因TLG1[45])組合導(dǎo)入釀酒酵母中，可用以生產(chǎn)啤酒或生物乙醇發(fā)酵。

2.3.2 葡糖淀粉酶

葡糖淀粉酶可以從淀粉分子和α-1,4糖苷鍵連接的麥芽寡糖非還原末端逐步水解釋放β-葡萄糖[46]，也可以低效水解α-1,6糖苷鍵[47]。

目前已報道的扣囊復(fù)膜酵母葡糖淀粉酶包括GLU、GLA、GLL、GLM(表2)，此外也在部分菌株基因組中發(fā)現(xiàn)與白色念珠菌葡糖淀粉酶基因GAM1同源的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)[11]。

表2Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株的葡糖淀粉酶特性

Table 2 Enzymatic properties of glucoamylase from severalSaccharomycopsisfibuligerastrains

EnzymeStrainsOptimal pHOptimal temperature (℃)Km (mmol/L) maltooligosacharideMaltoseMaltotrioseMaltotetraoseMaltoheptaoseRaw starch digestionAmino acids of mature proteinAmino acids of signal peptideVariant sites in the protein moleculeReferencesGLU HUT72125.8501.970.40.0870.053No49227E27,N46,E166,A377,A410,Y461,G467[4853]GLA KZ5.0-6.240-501.820.330.0810.05No49227D27,D46,K166,V377,G410,N461,S467[46,4951,5354]GLL R645.6-6.450NANANANANo492NAD27,D46,E166,V377,A410,Y461,G467[4950]GLMIFO 0111 4.8-5.040NANANANAYes48926NA[49,5558]

Note：NA,data not available;Different colors indicate that variant sites in GLL are the combination of some variant sites in GLU and GLA

將GLU和GLA基因?qū)脶劸平湍副磉_， GLU酶活力高于GLA酶活力[46,59]。兩者信號肽及N端的變異對酶的表達水平?jīng)]有影響，而C端的變異會同時影響酶活力、底物特異性、最適溫度和最適pH值。糖基化程度不同會導(dǎo)致表達產(chǎn)物不均一，影響熱穩(wěn)定性以及熱變性后的復(fù)性能力，但不影響酶活力[50,59]。將GLU中C端保守活性區(qū)域S5中的Gly467替換為GLA中的Ser，會使其與底物的親和性接近于GLA，酶的穩(wěn)定性降低，但與底物類似物阿卡波糖的結(jié)合能力提高[50]。

菌株IFO 0111產(chǎn)生的單一淀粉酶GLM是目前唯一報道的，可以降解生淀粉的扣囊復(fù)膜酵母葡糖淀粉酶[56-57]，而GLU、GLA和GLL只能較弱地吸附但不能降解生淀粉[51]。這是由于GLM中含有更多的色氨酸和組氨酸，其中的芳香族氨基酸(如色氨酸)可以通過疏水堆積作用與底物的糖環(huán)結(jié)合[51]。GLM可水解淀粉、糖原和極限糊精等多種多糖產(chǎn)生葡萄糖。GLM具有很高的脫支活性(Debranching Activity)，對含支鏈底物(如支鏈淀粉、糖原和極限糊精)的降解程度很高，但不能徹底降解直鏈淀粉[60]，其降解生淀粉的最適pH值為4.5，而降解可溶性淀粉的最適pH值為5.5。當(dāng)pH值為2.0-7.6時，GLM可以完全吸附在生淀粉上；該酶催化生淀粉的活性會被淀粉酶抑制劑阻遏，但其對淀粉的吸附性不受影響[57]。

大部分葡糖淀粉酶是由淀粉催化區(qū)域和結(jié)合區(qū)域通過O-糖基化區(qū)域連接而成[61]，但GLU和GLM都缺少獨立的淀粉結(jié)合區(qū)域，它們在酶的活性位點附近有一些與生淀粉結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基(GLM/GLU：D122/K121、H201/Y200、T204/S203、S205/T204、Q276/D277、S278/N282、S139/A138、E60/N60、V351/D354、T353/S356)[51]。在GLU表面距催化位點25 ?處有另一個淀粉結(jié)合位點，該位點處的Arg15、His447、Asp450、Thr462、Tyr464和Ser465具有重要作用。將其中部分氨基酸(Arg15Ala、His447Ala、Thr462Ala和His447Ala/Asp450Ala)突變后，GLU不能再與生淀粉結(jié)合。在GLM中部分氨基酸也很保守(Arg15、His444、Asp447、Thr459和Phe461)[47]，將GLM的His444和Asp447突變?yōu)锳la后，GLM結(jié)合生淀粉的能力下降，說明這一位點對結(jié)合生淀粉具有重要作用[62]。

3 扣囊復(fù)膜酵母對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

扣囊復(fù)膜酵母的代謝物對白酒香型、風(fēng)味的形成具有一定作用，其代謝譜與菌株[63-65]、酶活力[66]、培養(yǎng)基成分[67]及培養(yǎng)時間[67]有關(guān)。當(dāng)碳源為葡萄糖時，主要的揮發(fā)性代謝物包括2-苯乙醇、2-乙酸苯乙酯和苯乙酸乙酯，這些均為苯丙氨酸衍生物，呈果香或花香；主要的非揮發(fā)性代謝物包括3種碳水化合物(甘露糖、阿拉伯醇、甘露醇)、4種脂肪酸(丙酸、軟脂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸)、2種有機酸(草酸、琥珀酸)和8種氨基酸(異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸)[67]。當(dāng)培養(yǎng)基為高粱時，代謝物包括9種酯類、5種內(nèi)酯類、7種醇類、9種萘酚類、7種酸類和4種醛酮類化合物，其中6種化合物(苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲基丁酸和苯乙酸)為牛欄山二鍋頭白酒的重要生香成分[63]。

在米根霉、釀酒酵母中加入扣囊復(fù)膜酵母混合發(fā)酵可提升酒中總酸和氨基態(tài)氮的含量，同時大幅減少酒中的有害醇(甲醇、異丁醇、異戊醇)和總高級醇的含量，從而改善酒的品質(zhì)。推測其原因，可能是由于扣囊復(fù)膜酵母菌株無法將丙酮酸高效轉(zhuǎn)化為乙醇，轉(zhuǎn)而生成乳酸和乙酸等，間接抑制了高級醇的生成。除丁酸乙酯，其他酯類(乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯)和總低級酯在混合發(fā)酵中均有增加，使酒的風(fēng)味得到改善[66]。

4 展望

目前關(guān)于扣囊復(fù)膜酵母中的主要水解酶系和代謝譜已有大量研究，全基因組的公布也為進一步開發(fā)利用該物種提供了參考。鑒于扣囊復(fù)膜酵母的功能特性，未來還可通過對組學(xué)數(shù)據(jù)的進一步分析和分子生物學(xué)研究，闡明其在白酒發(fā)酵過程中的代謝通路調(diào)控，以及與其他白酒微生物的互作關(guān)系。此外，還需確定不同風(fēng)味白酒釀造中適應(yīng)不同工藝和發(fā)酵條件的扣囊復(fù)膜酵母菌株遺傳多樣性及其在生理、功能上的差異，從而為實際生產(chǎn)中篩選優(yōu)良菌株，改良白酒品質(zhì)提供參考依據(jù)。