基于電子自旋共振和拉曼光譜技術的榛子油氧化特性探析與評價*

崔娜娜 王貴禧 李如華 馬慶華 趙天田 梁麗松

(1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091；2.榛子產(chǎn)業(yè)國家創(chuàng)新聯(lián)盟 北京 100091；3.國家林業(yè)和草原局榛子工程技術研究中心 北京 100091；4.中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所 北京 100091)

榛子(Corylus)為多年生落葉灌木或喬木，與核桃(Jaglansregia)、杏仁(Prunusarmeniaca)、腰果(Anacardiumoccidentala)并稱世界“四大堅果”(秦桂珍等，2012)，是我國重要油料樹種之一，在我國西南—華中—河南、隴西—秦嶺、華北以及東北地區(qū)均有分布，遍及25個省(自治區(qū)、直轄市)(Yangetal., 2018)。平歐雜種榛(Corylusheterophylla×C.avellana)是以我國平榛為母本、歐洲榛為父本進行遠緣雜交獲得的新榛種，具有抗寒、大果和豐產(chǎn)的特性，目前我國已選育出40多個平歐雜種榛品種(系)。

榛仁含油量約 60%，以單不飽和脂肪酸為主，其相對含量達 85%以上，是典型的高單不飽和脂肪酸油脂(田文瀚，2012)；同時，榛仁還含有多種抗氧化成分，如類胡蘿卜素、生育酚、甾醇等(Alasalvaretal., 2006; Durmazetal., 2019)，在膳食營養(yǎng)和健康中起著重要作用。隨著榛子產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，榛子油作為一種高檔食用油，也越來越受消費者青睞。

榛子油不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)含量高，極易發(fā)生氧化反應，分解成短碳鏈的醛、酮、酸等小分子化合物，并產(chǎn)生強烈的“哈敗”氣味，品質(zhì)變差甚至失去食用價值(劉印志等，2017)。過氧化值(peroxide value,POV)、p-茴香胺值(p-anisidine value,AV)、總氧化值(total oxidation value,TV)和共軛二烯值等反映油脂氧化程度的常規(guī)指標是判斷和評價油脂品質(zhì)優(yōu)劣的重要方法(于修燭等，2009；Agregetal.，2017)。近年來，電子自旋共振(electron spin resonance,ESR)和拉曼光譜技術廣泛用于油脂氧化的檢測，其中，ESR是一種新型、靈敏的自由基檢測技術，可有效評價油質(zhì)氧化(Westermannetal., 2009; Chenetal., 2018);拉曼光譜技術靈敏度高，光譜振動帶特征峰可顯著表征化學基團和分子結構(Zhangetal., 2011)。

目前,國內(nèi)關于榛子油氧化的研究鮮有報道。研究榛子油氧化過程中的品質(zhì)變化規(guī)律、自由基產(chǎn)生規(guī)律以及油脂內(nèi)部分子結構的變化，揭示榛子油氧化特性，可為榛子油品質(zhì)及其食用安全性評價提供科學依據(jù)，對榛堅果加工利用具有重要意義。鑒于此，本研究對榛子油常規(guī)氧化指標、酸和總類胡蘿卜素含量的變化進行測定，采用ESR和拉曼光譜技術對榛子油氧化過程中自由基產(chǎn)生、油脂內(nèi)部化學基團和分子結構變化進行監(jiān)測，以揭示榛子油氧化規(guī)律，同時為ESR和拉曼光譜技術在榛子油品質(zhì)檢測中的應用提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9月末，在吉林省吉林市索特科技有限公司榛園采收平歐雜種榛主栽品種‘達維’正常成熟堅果。堅果經(jīng)自然晾曬至含水率為6.19%，脫殼后得榛仁(除去壞仁)。采用螺旋壓榨法，螺旋壓榨機加熱至100 ℃后，將榛仁置于壓榨機中榨取榛子油，收集備用。

1.2 加速氧化試驗

取9個培養(yǎng)皿(直徑12 cm、高2.3 cm)，分別加入180 g榛子油，隨機放在烘箱中。根據(jù)Bonoli-Carbognin等(2008)油脂加速氧化試驗方法，烘箱溫度設為60 ℃，避光。從0天開始，每5天取樣1次，每次取出1個培養(yǎng)皿，至40天結束，共9個時間點。取出的榛子油樣品置于棕色玻璃瓶中，在-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3 測定方法

1.3.1 油脂氧化指標測定 1)過氧化值(POV) 參考GB/T 5538—2005方法。測定3次生物學重復。

2)p-茴香胺值參考GB/T 24304—2009的方法。測定3次生物學重復。

3)總氧化值參考GB/T 24304—2009方法，TV=2×POV+ AV。

4)共軛二烯值 借鑒Agregán等(2017)方法，稍作修改。將榛子油溶于正己烷中，搖勻后于233 nm波長下測定吸光度值，以共軛二烯酸的百分比表示。測定3次生物學重復。

1.3.2 脂肪酸相對含量測定 采用氣相色譜法，參照Oliveira等(2008)方法，略有改動。稱取油樣100 μL加入甲酯化試劑和2 mL乙醚，放置2 h；隨后加入蒸餾水，將溶液分層，分離獲得有機相備用。取1 mL有機相于進樣瓶中，使用氣相色譜儀，采用外標面積歸一法測定脂肪酸相對含量。測定3次生物學重復。

1.3.3 總類胡蘿卜素含量測定 參考PORIM(1995)方法，稍作修改。稱取0.5 g油樣加入5 mL正己烷溶液，在波長450 nm下測定吸光度，利用β-胡蘿卜素(β-carotene)標準品繪制標準曲線。測定3次生物學重復。

1.3.4 自由基相對含量測定 精確配制1 mg·mL-1含PBN(N-叔丁基-α-苯基硝酮)的榛子油樣品。采用電子自旋共振波譜儀(JEOL FA-200，日本)設定溫度60 ℃，中心磁場322.126 mT，掃寬5 mT，掃描時間4 min。

1.3.5 拉曼光譜測定 采用高分辨率拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution，法國)，選用532 nm激光器，10倍物鏡，100%功率，掃描范圍100～3 200 cm-1，掃描時間10 s，累加次數(shù)1次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Ducan法進行單因素方差分析和相關性分析(P< 0.05)，利用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 榛子油氧化程度評價

油質(zhì)在不同氧化階段的氧化產(chǎn)物不同，通常采用多個指標綜合評價油質(zhì)的氧化程度。本研究采用60 ℃烘箱法進行榛子油加速氧化試驗，測定榛子油在氧化過程中的POV、AV、TV和共軛二烯值變化其如圖1所示。

POV用于判斷油脂新鮮程度和質(zhì)量等級，是在氧化初期衡量油脂氧化程度的重要指標(孫月娥等，2010；Zhangetal.，2010)。由圖1A可知，隨著氧化時間延長，榛子油不同階段的POV變化速率不同。在氧化初始階段(0～5天)，POV變化很??；氧化5～30天期間，POV隨氧化時間延長快速增加，并在15天時達42.34 meq·kg-1，超過GB 2716—2018規(guī)定的食用油POV(≤19.7 meq·kg-1)上限，品質(zhì)顯著降低，喪失食用價值；氧化40天結束后，POV顯著增加至370.47 meq·kg-1，表明榛子油氧化程度急劇升高。

AV用于衡量伴隨初級產(chǎn)物生成的二級氧化產(chǎn)物(Poiana, 2012)是油質(zhì)氧化次級產(chǎn)物的主要檢測指標之一，其值越大，表明油脂的氧化劣變越嚴重。由圖1B可知，榛子油AV變化趨勢不同于POV。在氧化過程的前25天，AV增加速度緩慢，從初始的0.31增加至1.03，僅增加0.72；氧化25天后，AV開始急劇增加。

TV可全面反映油脂的氧化狀態(tài)，代表劣變氧化指數(shù)(Shahidietal., 2002)。由圖1C可知，榛子油TV與POV的變化趨勢基本一致。氧化5天，時TV變化不顯著，僅比初始值增加3.12；氧化10天時，TV開始急速增加，達44.04；在隨后的氧化過程中，TV一直呈快速增加趨勢，氧化40天時，TV高達766.85，是初始時(0天)的60.15倍。

共軛二烯是油脂氧化過程中產(chǎn)生的初次氧化產(chǎn)物(weberetal.，2008)，可進一步氧化形成低分子的醛和酮，能夠反映油脂過氧化的程度(Halliwelletal., 1993)。由圖1D可知，榛子油氧化過程中共軛二烯值呈一直升高的變化趨勢，變化范圍為0.12～3.48。氧化0～30天期間，共軛二烯值增加趨勢較為緩慢，僅升高1.16；氧化35天時，共軛二烯值急劇增加，高達3.46，說明此期間榛子油氧化程度顯著升高，品質(zhì)快速降低。

2.2 脂肪酸相對含量

脂肪酸是油脂的主要成分，油脂氧化劣變從不飽和脂肪酸的氧化開始。由表1可知，榛子油的脂肪酸組成主要為油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、花生酸(C20∶0)和亞麻酸(C18∶3)，其中油酸相對含量最高(83.41%)，其次是亞油酸(9.97%)和棕櫚酸(4.40%)。隨著氧化時間延長，油酸相對含量逐漸增加，氧化25天后其增加速率明顯加快，氧化40天時比初始值增加2.35%；棕櫚酸和花生酸相對含量的變化趨勢與油酸基本一致，分別增加0.24%和0.03%。亞油酸和亞麻酸因含有多個雙鍵，更容易氧化，其相對含量在整個氧化過程中逐漸降低，分別從9.97%和0.10%降至7.15%和0.05%。棕櫚油酸和硬脂酸相對含量保持穩(wěn)定，沒有顯著改變。

圖1 榛子油加速氧化過程中氧化指標的變化

表1 榛子油脂肪酸主要組成及相對含量①

由圖2A可知，在加速氧化的前20天，榛子油不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)相對含量均無顯著變化(P> 0.05)；氧化25天時，飽和脂肪酸相對含量降低，而不飽和脂肪酸相對含量增加；在隨后的氧化進程中，飽和脂肪酸相對含量逐漸增加，不飽和脂肪酸相對含量逐漸降低。由圖2B可知，隨著氧化時間延長，單不飽和脂肪酸相對含量呈顯著上升的變化趨勢，其主要貢獻源于油酸相對含量增加，而多不飽和脂肪酸相對含量呈顯著降低的變化趨勢，主要是因為亞油酸和亞麻酸相對含量減少。

圖2 榛子油氧化過程中脂肪酸相對含量變化

2.3 總類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的功效。由圖3可知，榛子油含有豐富的總類胡蘿卜素，含量為2.62 μg β-carotene·g-1。氧化5天時，總類胡蘿卜素含量顯著增加，達2.95 μg β-carotene·g-1，隨后則持續(xù)降低，至氧化25天時，總類胡蘿卜含量降低至1.69 μg β-carotene·g-1；氧化30天時，總類胡蘿卜素含量為0。氧化25天時，肉眼可見榛子油顏色變淺，氧化30天時變?yōu)闊o色(圖4)，與此時總類胡蘿卜素含量結果吻合。

圖3 榛子油加速氧化過程中總類胡蘿卜素含量的變化

圖4 榛子油加速氧化過程中顏色的變化

2.4 自由基變化規(guī)律

自由基的產(chǎn)生對促進油脂氧化具有重要作用，本研究利用ESR監(jiān)測榛子油氧化過程中自由基相對含量的變化。由圖5A可知，在60 ℃共振腔放置60 min時，氧化0～15天的榛子油幾乎看不到PBN-加合物信號，氧化20天時開始出現(xiàn)微弱的PBN-加合物信號，且隨著氧化時間延長，信號也逐漸增強。由圖5B可知，隨著氧化時間延長，榛子油自由基相對含量不斷增加；氧化0～25天自由基相對含量從8.41緩慢增加至12.96，氧化25天后自由基相對含量急劇增加，至氧化40天時自由基相對含量高達28.09，且不同氧化時間的榛子油自由基相對含量之間存在顯著差異(P< 0.05)。

圖5 榛子油加速氧化過程中自由基的變化

2.5 拉曼光譜變化

圖6 榛子油的拉曼光譜及主要特征峰

圖7 榛子油加速氧化過程中拉曼光譜和強度的變化

由圖7A、B可知，在榛子油氧化過程中，拉曼光譜的一些特征峰強度隨著氧化時間延長呈減弱趨勢，說明其對應分子基團含量降低。榛子油氧化會改變分子內(nèi)部結構以及基團之間的相互影響，特征峰位移也會發(fā)生微小變化。分析可知，榛子油氧化過程中972、1 080、1 158、1 268、1 524、1 746和3 008 cm-1處的特征峰強度發(fā)生了明顯變化。其中以2個類胡蘿卜素(1 158和1 524 cm-1)、反式脂肪酸(972 cm-1)和順式雙鍵(1 268 cm-1)特征峰變化最顯著。以相對穩(wěn)定的甲基δ(CH2)特征峰(1 441 cm-1)信號強度為對照，拉曼相對強度I972 cm-1/I1 441 cm-1、I1 268 cm-1/I1 441 cm-1、I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1隨著氧化時間的變化如圖7D所示。榛子油氧化25天時，I972 cm-1/I1 441 cm-1和I1 268 cm-1/I1 441 cm-1均呈小幅波動升高趨勢，分別從0.37和0.55變化至0.40和0.57，但在隨后氧化過程中二者的拉曼相對強度均呈快速降低趨勢，氧化40天時拉曼相對強度僅為0.30和0.47。I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1的變化趨勢保持一致，即在整個氧化過程中拉曼強度快速降低，分別從0.59和0.62降低至0.20和0.15，表明類胡蘿卜素基團含量在此期間急劇下降，與總類胡蘿卜素含量變化趨勢一致。

2.6 氧化過程中各指標的相關性

對氧化過程中各指標的相關性分析(表2)可知，油脂氧化程度評價指標(POV、AV、TV和共軛二烯值)均與飽和脂肪酸相對含量呈極顯著正相關(P< 0.01)，與不飽和脂肪酸相對含量和總類胡蘿卜素含量呈極顯著負相關(P< 0.01)。由此可見，飽和脂肪酸相對含量增加與不飽和脂肪酸相對含量減少是榛子油氧化的重要特征，與POV、AV、TV和共軛二烯值具有顯著對應關系，這4個常規(guī)氧化指標可很好評價榛子油的氧化程度；總類胡蘿卜素含量與榛子油氧化的密切關系使其可以成為判斷榛子油氧化程度的重要指示物。

POV、AV、TV和共軛二烯值與自由基相對含量呈極顯著正相關(P< 0.01)，與拉曼相對強度(I972 cm-1/I1 441 cm-1、I1 268 cm-1/I1 441 cm-1、I1 158 cm-1/I1 441 cm-1和I1 524 cm-1/I1 441 cm-1)呈極顯著負相關(P< 0.01)，自由基相對含量和拉曼光譜特征峰強度可以很好地表征榛子油的氧化程度。

自由基相對含量與不飽和脂肪酸相對含量和總類胡蘿卜素含量呈極顯著負相關(P< 0.01)，與飽和脂肪酸相對含量呈極顯著正相關(P< 0.01)。在榛子油氧化過程中，由于自由基的產(chǎn)生，導致不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素中的不穩(wěn)定雙鍵被逐漸氧化成相對穩(wěn)定的單鍵，不飽和脂肪酸相對含量減少，而飽和脂肪酸相對含量增加，總類胡蘿卜素含量降低。

3 討論

油脂氧化穩(wěn)定性是評價油脂品質(zhì)的重要指標，不同油脂具有不同為脂肪酸組成和不同的抗氧化成分，成為影響油脂氧化穩(wěn)定性的重要因素。學者們已對脂肪酸氧化進行廣泛研究(Prattetal., 2003；Sullivanetal., 2011; Yettellaetal., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，榛子油氧化過程中脂肪酸相對含量變化顯著，其中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸相對含量逐漸增加，多不飽和脂肪酸相對含量逐漸減少，氧化25天時不飽和脂肪酸相對含量增加可能是多不飽和脂肪酸被氧化相對含量減少所致。類胡蘿卜素是重要的脂溶性活性成分，存在于很多植物油脂中，精煉會導致類胡蘿卜素損失(Durmazetal.,2019)。油脂氧化過程中類胡蘿卜素含量會隨之變化，Yi等(2011)研究魚油/棕櫚油混合油中生育酚、生育三烯酚和類胡蘿卜素在氧化過程中的交互作用，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素含量隨著氧化而降低。榛子油內(nèi)含豐富的類胡蘿卜素，本研究發(fā)現(xiàn)，總類胡蘿卜素含量減少是榛子油顏色變淺的直接原因，可見總類胡蘿卜素含量變化可在一定程度上指示榛子油的氧化程度。

表2 榛子油加速氧化過程中各指標的相關性分析①

① *表示在0.05 水平差異顯著; **表示在0.01水平差異顯著。* means significantly correlated at the 0.05 level; **means significantly correlated at the 0.01 level.

油質(zhì)氧化的實質(zhì)是其結構中不飽和脂肪酸的氧化，可通過光氧化、酶促氧化和自動氧化3種途徑進行，其中自動氧化為活化的含烯底物(如不飽和脂肪酸)與基態(tài)氧在室溫下發(fā)生非酶自由基鏈式反應，是食用油脂品質(zhì)劣變的主要原因(孫月娥等，2010)。自由基鏈式反應歷程可分為鏈引發(fā)、鏈傳遞、鏈終止(Choeetal.,2006)，氧化過程中產(chǎn)生的大多數(shù)自由基不穩(wěn)定，只有通過ESR才可以測定(Jerzykiewiczetal., 2011)。Chen等(2018)探索牛肉脂質(zhì)氧化過程，結果表明，隨著反復凍融次數(shù)增加，自由基相對含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著榛子油加速氧化時間延長，自由基相對含量不斷升高，特別是氧化25天時自由基開始快速大量生成，表明榛子油品質(zhì)快速降低，與常規(guī)氧化指標測定結果一致。

油質(zhì)氧化過程中因不飽和鍵丟失導致分子內(nèi)部結構改變，從而引起了特征峰拉曼強度的變化。Lyndgaard等(2012)研究指出，1 080 cm-1處的拉曼強度與油脂不飽和度呈正相關；Berhe等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，972和1 264 cm-1處的拉曼強度與油脂不飽和度呈正相關(Berheetal., 2016)，但林新月等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油和魚油972 cm-1處的拉曼強度與油脂不飽和度呈負相關，這可能是因為油脂種類不同導致972 cm-1處的特征峰拉曼強度在油質(zhì)氧化過程中出現(xiàn)不同變化趨勢；Sánchez-Alonso等(2012)發(fā)現(xiàn)1 746 cm-1處的拉曼強度與油脂不飽和度呈正相關；Li-Chan等(1994)發(fā)現(xiàn)3 008 cm-1處的拉曼信號代表油脂中的不飽和酸。本研究發(fā)現(xiàn)，榛子油氧化過程中1 080、1 746和3 008 cm-1處的特征峰強度均呈減弱趨勢；氧化25天時拉曼相對強度I972 cm-1/I1 441 cm-1和I1 268 cm-1/I1 441 cm-1均出現(xiàn)升高趨勢，可能與榛子油高不飽和度有關；氧化30天時拉曼相對強度I1 158 cm-1/I1 441 cm-1、I1 524 cm-1/I1 441 cm-1大幅度降低，且特征峰信號消失，表明榛子油中對應類胡蘿卜素基團含量已大量減少甚至消失。

本研究還發(fā)現(xiàn)，常規(guī)氧化指標POV、AV、TV和共軛二烯值與自由基相對含量和拉曼強度具有極顯著相關性，證明電子自旋共振和拉曼光譜技術可用于評價榛子油的氧化程度。

4 結論

榛子油氧化大致分為3個階段，即初始緩慢氧化階段(0～10天)、中間快速氧化階段(10～20天)和后期深度氧化階段(20天以后)，綜合4個常規(guī)氧化指標(POV、AV、TV和共軛二烯值)可以很好評價榛子油的氧化程度。拉曼光譜反式脂肪酸(972 cm-1)和順式雙鍵(1 268 cm-1)特征峰可準確反映榛子油氧化過程中脂肪酸的組成變化；類胡蘿卜素是榛子油色澤的主要貢獻因子，與榛子油氧化程度密切相關，利用拉曼光譜中類胡蘿卜素特征峰強度可直接預測類的總胡蘿卜素含量的變化趨勢，進而判斷榛子油的氧化程度。自由基相對含量、拉曼光譜特征峰強度和總類胡蘿卜素含量與常規(guī)氧化指標具有極顯著相關性，證明電子自旋共振和拉曼光譜技術可用于評價榛子油的氧化程度。電子自旋共振和拉曼光譜技術作為傳統(tǒng)油質(zhì)氧化評價方法的補充或替代具有很大潛力，可為油脂品質(zhì)快速檢測提供新方法。