狹葉小金梅草組織培養(yǎng)與快速繁殖

李洪林，鐘志祥，謝 娟，胡光萬

(中國科學(xué)院武漢植物園，湖北 武漢 430074)

近幾十年來，人們對仙茅科(Hypoxidaceae，APG分類系統(tǒng))植物識別、栽培和藥用價值方面的研究較多，也取得較大進(jìn)展，但僅局限在仙茅屬(Curculigo)植物的研究[1—4]。對該科小金梅草屬(Hypoxis)的研究國內(nèi)并不多見，但其價值不容忽視[5]。究其原因，是國內(nèi)這個屬的植物并不多，沒有引起足夠的重視。但是，小金梅草屬植物的藥用價值和用途卻受到世界上其他國家的廣泛關(guān)注[6—11]。

小金梅草屬植物約100種，廣泛分布于熱帶地區(qū)，我國僅 1種[6]。該屬植物具球莖，可在地下躲過生長環(huán)境惡劣的冬季或旱季，直至下一個生長季節(jié)繼續(xù)生長。其球莖切面呈現(xiàn)白色或黃色(有的為橙色)，具粘液，切口(或切片)暴露在空氣中會很快被氧化變黑。本屬的大多數(shù)種類葉基生，呈線形，分兩列；花呈亮黃色。

小金梅草屬植物具有廣泛的藥用與觀賞價值。在非洲大陸具有悠久的藥用歷史，如Hypoxis hemerocallidea和H. colchicifolia是南非傳統(tǒng)藥物，可制作藥酒，H. hemerocallidea亦被用作艾滋病的免疫助推器等；此外，小金梅草屬植物由于多年生且觀賞性較強(qiáng)，花期較長，無花時可觀葉，也是園林地被植物的選擇之一[7—11]。狹葉小金梅草(H.angustifolia)為小金梅草屬植物，原產(chǎn)于非洲且分布十分廣泛。非洲當(dāng)?shù)厝撕茉缇屠迷撝参镏委熞恍┨厥獾募膊?，如剛果傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，狹葉小金梅草通常被用作類血球和鐮狀細(xì)胞病的治療藥物[12]。此外，在非洲其他地方，它還被用作治療疝氣和溫腎[10]。據(jù)研究，從狹葉小金梅草根狀莖中分離的(Z)-1-(4-羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-l,4-戊二烯和亞氧苷等可能是主要的藥用成分[13]。

為了研究和利用小金梅草屬植物，本文以狹葉小金梅草為材料，展開組織培養(yǎng)研究，以期獲得大規(guī)模幼苗組培技術(shù)，為后期研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

狹葉小金梅草為多年生草本，高可達(dá) 45 cm，球莖近球形，直徑1.5～3 cm。球莖切面為白色，球莖頂部為濃密剛毛。葉片線形或披針形，4～14枚，長可達(dá) 40 cm，葉邊緣和中脈具濃密的毛?？偁罨ㄐ?，1～6枝，15～20 cm長，多毛，每枝總狀花序具花1～4朵，花黃色，直徑10～18 mm，花柄柔軟多毛。狹葉小金梅草主要分布在熱帶非洲，肯尼亞、坦桑尼亞、烏干達(dá)、南非等地都有分布[14—16]。本研究供試的狹葉小金梅草為 2015年采自非洲東部國家肯尼亞，當(dāng)?shù)睾０?000 m，屬于赤道高原地區(qū)。采取當(dāng)年7月初始花蕾作為外植體。

1.2 培養(yǎng)條件

(1)花蕾愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS + 6-BA 0.8 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ TDZ 0.1 mg·L-1；(2)愈傷誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基：MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.02 mg·L-1+AC(活性碳) 0.2 g·L-1；(3)芽增殖與生根繼代培養(yǎng)基：MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 花寶 1 號1 g·L-1+ AC(活性碳) 0.2 g·L-1；(4)壯苗生根培養(yǎng)基：1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.02 mg·L-1+ AC 0.5 g·L-1。以上培養(yǎng)基蔗糖濃度(1)、(2)、(3)為 3.0%，(4)為 2.0%；瓊脂 5.5 g·L-1，pH 5.8，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，連續(xù)光照 12 h·d-1，光照強(qiáng)度 2000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷誘導(dǎo)

取母株當(dāng)年長出的健壯初始花蕾(圖1: a)，自來水沖洗1 h，先用75%乙醇消毒30 s，再用10%次氯酸鈉溶液消毒25 min，無菌水沖洗8～10次，用消毒濾紙吸干表面水分，將花蕾接種至培養(yǎng)基(1)中。20～30 d左右花蕾中心開始膨脹(圖1: b)，一周后逐漸有綠色嫩芽萌發(fā)(圖1: c)，萌發(fā)誘導(dǎo)率30～50倍。

圖1 狹葉小金梅草組織培養(yǎng)Fig. 1 Tissue culture of Hypoxis angustifolia

2.2 芽誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

將獲得的側(cè)芽切分成小段，轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基(2)中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，30 d為1個繼代增殖周期。一般1個芽可增殖形成3～5個側(cè)芽；隨著繼代次數(shù)的增加，增殖速度逐漸加快，增殖系數(shù)可達(dá)10～20倍(圖1: d)。30 d后，花蕾誘導(dǎo)出球形愈傷后，出現(xiàn)綠色叢生芽(圖 1: e)。將叢生芽轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基(3)中進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)率10～15倍。

2.3 生根培養(yǎng)

叢生芽培養(yǎng)25 d逐漸成苗后(圖1: f)，將其切開成單個植株，接至培養(yǎng)基(4)進(jìn)行生根培養(yǎng)。30 d后長出4～6條根，生根率達(dá)95%。

2.4 煉苗與移栽

先將組培苗移至自然光照下，不打開瓶蓋，使其逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。適應(yīng)3 d后，將小苗取出，洗凈根部瓊脂，在陰處晾干，將生根苗移栽至泥土：蛭石按3：1配制的基質(zhì)中，表面噴水，再用塑料薄膜覆蓋，保持空氣相對濕度60%以上，環(huán)境溫度18～20 ℃，25～35 d可觀察煉苗成活情況(圖1: g)，6個月后成活穩(wěn)定(圖1: h)，成活率達(dá)80%。

3 討論

狹葉小金梅草的組培繁殖此前未見報道，其組培技術(shù)仍處于摸索階段。但仙茅科仙茅屬植物在國內(nèi)有一些研究[17]。與仙茅(Curculigo orchioides)的組培不同，本研究狹葉小金梅草組培的外植體為花芽，并取得成功，而根、莖、葉并沒有產(chǎn)生誘導(dǎo)愈傷組織，推測狹葉小金梅草在細(xì)胞分化過程中，并非所有細(xì)胞都分化形成成熟組織，而是只有少數(shù)的孢原細(xì)胞遺留下來，當(dāng)具備再生條件時，這類孢原細(xì)胞便可增殖。另一方面，狹葉小金梅草分化后的細(xì)胞，也較難脫分化再進(jìn)行增殖，這在作者的多次試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。狹葉小金梅草的組培取得成功，對于該種來自遙遠(yuǎn)國度的植物的研究已邁出第一步，為其繁育提供了方法，也為今后的擴(kuò)大栽培以及應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。