醬香型蜂蜜配制酒的工藝優(yōu)化及體外抗氧化能力分析

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

醬香型白酒在茅臺(tái)酒的帶動(dòng)下，以其高端國(guó)酒優(yōu)勢(shì)，純糧釀造無(wú)添加等優(yōu)良特性，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞[1]，且具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香”的鮮明風(fēng)格，呈現(xiàn)出快速發(fā)展的良好態(tài)勢(shì)。蜂蜜是一種天然的甜味物質(zhì)，它是由蜜蜂采集花蜜或植物的葉莖上的蜜露或者其它昆蟲(chóng)的代謝物，然后混合自身所分泌的特殊物質(zhì)，在蜂巢中經(jīng)過(guò)充分釀制而成的[2]。蜂蜜的使用可以追溯到人類(lèi)社會(huì)開(kāi)始的時(shí)候，曾經(jīng)被用作一種貨幣或貢品[3]。蜂蜜含維生素、礦物質(zhì)、酶、風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸和多種揮發(fā)性化合物，具有促進(jìn)糖代謝，解毒，抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，通便利腸等藥理作用[4]。

傳統(tǒng)的蜂蜜酒是以純正蜂蜜為原料，經(jīng)稀釋、發(fā)酵、澄清、過(guò)濾、陳釀后制得的低酒精度發(fā)酵酒，如今大多數(shù)的蜂蜜酒仍以發(fā)酵型為主，鮮少有配制型蜂蜜酒。而市場(chǎng)上的配制酒酒基一般為黃酒、米酒與普通白酒，少見(jiàn)將醬香型白酒作為配制酒酒基的報(bào)道。本研究將醬香型白酒與蜂蜜結(jié)合，并輔以營(yíng)養(yǎng)豐富且具有藥用價(jià)值的枸杞、陳皮、山楂、龍眼干，擬開(kāi)發(fā)一種具有醬香型風(fēng)味特征的蜂蜜配制酒，既能保留天然蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)和香味，又兼有醬香酒的風(fēng)味特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

陳皮、山楂、枸杞、龍眼干、蜂蜜：市售，其中龍眼干為干制龍眼去殼去核；53%vol醬香型白酒：茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠。

蘆丁標(biāo)品：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子天平（AE100S型）：梅特勒-托利多儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPE-150B-Z型）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HHM6型）：金壇市中大儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 單因素試驗(yàn)

料液比的確定：在浸泡時(shí)間為8 d，溫度為20℃同一條件下，以料液比 1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL）泡制，經(jīng)過(guò)濾后各加入15%蜂蜜進(jìn)行調(diào)配，根據(jù)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法評(píng)析，確定最適料液比。

蜂蜜添加量的確定：在浸泡時(shí)間為8 d，溫度為20℃，料液比為1∶8（g/mL）同一條件下，泡制過(guò)濾后添加5%、10%、15%、20%、25%蜂蜜，根據(jù)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法評(píng)析，確定最適蜂蜜添加量。

泡制時(shí)間的確定：在溫度為20℃，料液比為1 ∶8（g/mL）同一條件下，設(shè)定浸泡時(shí)間 4、6、8、10、12 d，泡制過(guò)濾后各加入15%蜂蜜進(jìn)行調(diào)配，根據(jù)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法評(píng)析，確定最適泡制時(shí)間。

泡制溫度的確定：在浸泡時(shí)間為8 d，料液比為1 ∶8（g/mL）同一條件下，設(shè)定泡制溫度 5、10、15、20、25℃，泡制過(guò)濾后各加入15%蜂蜜進(jìn)行調(diào)配，根據(jù)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法評(píng)析，確定最適泡制溫度。

1.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、泡制時(shí)間、泡制溫度、蜂蜜添加量為試驗(yàn)因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Experimental factors and levels of response surface

1.3.4 醬香型蜂蜜混合配制酒的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)

感官指標(biāo)在衡量產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)品可接受性中有著不可替代的作用，但我國(guó)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系不完善以及評(píng)價(jià)技術(shù)不成熟造成現(xiàn)在普遍運(yùn)用的感官評(píng)定方法存在著程序復(fù)雜、主觀性強(qiáng)、費(fèi)時(shí)、誤差大及不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)判產(chǎn)品質(zhì)量[5]。蜂蜜營(yíng)養(yǎng)豐富、保健功效顯著，屬天然營(yíng)養(yǎng)佳品、藥食同源食物[6-7]。很久以前蜂蜜就被用來(lái)治療傷口，因?yàn)榉涿劬哂锌寡?、殺菌劑、抗生素的屬性。Jose M.Alvarez-Suarez等[8]的研究顯示蜂蜜的這種屬性可能與蜂蜜本身含有的酚類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。董蕊等[9]的研究表明蜂蜜中的多酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)影響蜂蜜的抗氧化活性，抗氧化能力與黃酮、酚酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。此外，陳皮、山楂中也含有豐富的黃酮類(lèi)化合物。因此，除了考察感官指標(biāo)以外，本試驗(yàn)還將酒體中的功能成分總黃酮含量、酚酸含量納入評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中。

多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法（multi－index comprehensive evaluation method，MCEM）通過(guò)對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)打分，將各指標(biāo)最優(yōu)分值加權(quán)加和得總分值來(lái)評(píng)價(jià)處方的優(yōu)劣[10]。根據(jù)各評(píng)價(jià)因素對(duì)酒體質(zhì)量的影響程度，采用強(qiáng)制決定法[11]，確定感官指標(biāo)為0.4，總黃酮含量為0.3，酚酸含量為0.3。即：醬香型蜂蜜混合配制酒的綜合評(píng)分=總黃酮含量×0.3＋酚酸含量×0.3＋感官評(píng)分×0.4。

1.3.5 醬香型蜂蜜配制酒體外抗氧化試驗(yàn)

自由基具有高度的活性和極強(qiáng)的氧化能力，能夠攻擊體內(nèi)生物大分子及各種細(xì)胞，造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老并誘發(fā)各種疾病?？寡趸镔|(zhì)能夠抑制活性氧簇和自由基的產(chǎn)生，加速清除或者抑制其對(duì)大分子的氧化損傷作用。多酚、黃酮類(lèi)化合物含量豐富的天然產(chǎn)物具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力[12]，且其有效成分都具有良好的醇溶性。通過(guò)化學(xué)方法測(cè)定天然產(chǎn)物自由基清除率，能夠評(píng)價(jià)其抗氧化活性。采用化學(xué)法比較醬香蜜酒與原醬香型白酒在清除DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基及還原力大小來(lái)分析醬香蜜酒的體外抗氧化能力。

1.3.6 指標(biāo)檢測(cè)方法

總黃酮含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[13]；酚酸含量的測(cè)定和DPPH自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14]；ABTS+自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[15]；羥自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16]；還原力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]；感官評(píng)定：選10名經(jīng)感官培訓(xùn)過(guò)的研究生同學(xué)組成評(píng)分小組。參考葡萄酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，采用十分制，取平均值為最終分?jǐn)?shù)，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 醬香型蜂蜜混合配制酒感官評(píng)分表Table 2 The sensory evaluation standard of sauce-flavored mead

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert.8.05b設(shè)計(jì)響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化與分析試驗(yàn)，SPSS 22.0用于數(shù)據(jù)方差分析，每組試驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響

料液比對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖1可知，隨著溶劑體積的增大，酒體中黃酮含量、酚酸含量逐漸呈下降趨勢(shì)，感官評(píng)分逐漸上升，醬香蜜酒的綜合評(píng)價(jià)緩慢增高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時(shí)，其綜合評(píng)價(jià)最高。原因是當(dāng)白酒體積占比較小時(shí)，酒體中含較多的黃酮、酚酸等物質(zhì)，但其果香味過(guò)重，當(dāng)料液比較大時(shí)，酒體中黃酮酚酸含量較少且果香味不足。

2.1.2 蜂蜜添加量對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響

蜂蜜添加量對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響見(jiàn)圖2。

蜂蜜可以看做是一種過(guò)飽和的糖溶液，糖和水的量占到其干重的95%以上，維生素、礦物質(zhì)、酶、風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸和多種揮發(fā)性化合物構(gòu)成次要成分，不過(guò)正是其次要成份決定了不同蜂蜜的感官及營(yíng)養(yǎng)特性[4]。蜂蜜添加量較低時(shí)，酒體中總黃酮、酚酸含量也相對(duì)較低，但當(dāng)蜂蜜添加量較高時(shí)，黃酮含量、酚酸含量上升平緩，但糖含量偏高，酒體過(guò)甜，感官效果較差。由圖2可知，當(dāng)蜂蜜添加量為15%時(shí)，其綜合評(píng)價(jià)最好。

圖2 蜂蜜添加量對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Amount of honey added on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

2.1.3 泡制時(shí)間對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響

泡制時(shí)間對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 泡制時(shí)間對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of brewing time on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖3可知，酒體中的黃酮含量、酚酸含量及感官評(píng)分都隨著泡制時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢上升。在第8天以后，黃酮含量、酚酸含量上升不大，逐漸穩(wěn)定，醬香蜜酒此時(shí)綜合評(píng)價(jià)最高。原因是在較短的時(shí)間內(nèi)，浸泡物所含物質(zhì)未完全溶入酒體，因而總黃酮、酚酸含量不高，酒體感官也更接近于原酒口感風(fēng)格。隨著時(shí)間延長(zhǎng)浸出物達(dá)到飽和，感官評(píng)價(jià)也無(wú)較大變動(dòng)。

2.1.4 泡制溫度對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響

泡制溫度對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 泡制溫度對(duì)醬香蜜酒綜合品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of brewing temperature on the comprehensive quality of sauce-flavored mead

由圖4可知，在溫度為20℃時(shí)，醬香蜜酒綜合品質(zhì)最好。溫度能顯著地影響物質(zhì)的的溶解度[18]，隨著溫度升高，酒體中的黃酮含量、酚酸含量、感官評(píng)分都逐漸上升，最后逐漸趨于平緩。在低溫條件下，總黃酮、酚酸溶解度不高，但溫度若設(shè)置過(guò)高則會(huì)使酒精揮發(fā)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果

以料液比、浸泡溫度、浸泡時(shí)間及蜂蜜添加量為自變量，以醬香型蜂蜜混合配制酒綜合評(píng)價(jià)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and test results

2.2.2 響應(yīng)面模型的建立及其顯著性

采用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程方差分析表，進(jìn)行非線(xiàn)性回歸二次多項(xiàng)式擬合，得到如下回歸方程預(yù)測(cè)模型：醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)分值=4.33+0.46A-0.15B+0.013C-0.020D+0.083AB-0.10AC-0.11AD-0.11BC-0.033BD-0.059CD-0.28A2-0.30B2+0.018C2-0.083D2?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。

根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)，該模型回歸極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說(shuō)明模型在回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.953 9，相關(guān)性較好，說(shuō)明該模型可用于預(yù)測(cè)最優(yōu)配方的實(shí)際情況。

由表4可知，回歸方程中的料液比（A）、蜂蜜添加量（B）以及二次項(xiàng) A2、B2均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），料液比與時(shí)間（AC）、料液比與溫度（AD）、蜂蜜添加量與時(shí)間（BC）交互項(xiàng)以及二次項(xiàng)D2達(dá)到顯著水平。表明各因素對(duì)響應(yīng)值綜合評(píng)價(jià)的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。方差分析中 FA=147.27，F(xiàn)B=16.68，F(xiàn)C=0.12，F(xiàn)D=0.27。即各因素對(duì)醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)的影響程度大小順序?yàn)椋毫弦罕龋痉涿厶砑恿浚緶囟龋緯r(shí)間。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression equation coefficient significance test

據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，圖形形狀與3D圖傾斜度都能反映出各因素之間的相互關(guān)系。等高線(xiàn)為圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著；3D圖傾斜度越高，坡度越陡，說(shuō)明兩因素交互作用越顯著。

圖5 交互項(xiàng)對(duì)于醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)顯著的響應(yīng)面圖Fig.5 Interaction term for the elastic surface of the comprehensive quality of sauce-flavored mead

從圖5中的（1）、（2）可以直觀地看出，料液比與蜂蜜添加量、蜂蜜添加量與溫度的等高線(xiàn)為圓形，交互作用不顯著，從圖5（3）和（4）可以看出料液比與溫度、料液比與時(shí)間的3D圖傾斜度高，交互作用顯著。

2.2.3 響應(yīng)面最終優(yōu)化配方及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面得出料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，時(shí)間為6 d，溫度為17.82℃為醬香型蜂蜜混合配制酒的最優(yōu)組合。在此條件下預(yù)測(cè)醬香型蜂蜜混合配制酒綜合評(píng)分為4.63?？紤]到醬香蜜酒實(shí)際操作的方便性，故將醬香蜜酒的配方組合修正為：料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，時(shí)間為6 d。溫度為18℃。并在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)值為4.69，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為1.3%，其驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值的誤差在允許誤差5%內(nèi)，說(shuō)明該模型合理可靠。

2.3 醬香蜜酒體外抗氧化能力分析

對(duì)采用最終優(yōu)化配方制作的醬香蜜酒進(jìn)行體外抗氧化分析，以基酒醬香型白酒作為對(duì)比，比較兩者體外抗氧化能力的強(qiáng)弱，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 醬香蜜酒及原醬香型白酒自由基清除率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of free radical scavenging rate of sauce-flavored mead and original sauce-flavor liquor

蜂蜜具有較好的抗氧化性是與其黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、抗壞血酸、過(guò)氧化氫酶、類(lèi)胡蘿卜素及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有關(guān)[19-20]。由表5可看出，醬香蜜酒對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為87.24%、90.38%、81.25%、1.877，原醬香型白酒對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為9.01%、4.26%、8.04%、0.017，其中還原力值越大，其還原能力越強(qiáng)。結(jié)果表明醬香蜜酒體外抗氧化能力顯著高于原醬香型白酒。這是因?yàn)殍坭?、山楂、陳皮、龍眼及蜂蜜中含有較多的抗氧化活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法建立了料液比、蜂蜜添加量、浸泡時(shí)間、浸泡溫度4個(gè)因素對(duì)于醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)的二次回歸方程模型，并優(yōu)化出醬香蜜酒最優(yōu)的制作工藝。根據(jù)響應(yīng)面方法優(yōu)化的結(jié)果以及考慮到實(shí)際操作的方便性，最終確定醬香蜜酒的最優(yōu)制作工藝為：料液比為1∶8.3（g/mL），蜂蜜添加量為15%，浸泡時(shí)間為6 d，泡制溫度為18℃，將醬香蜜酒綜合評(píng)價(jià)作為響應(yīng)值，所得驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為4.69，所產(chǎn)生的誤差為1.3%，說(shuō)明該回歸方程具有較高的可信度。以最終優(yōu)化配方制作的醬香蜜酒對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為87.24%、90.38%、81.25%、1.877，原醬香型白酒對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除率及還原力分別為9.01%、4.26%、8.04%、0.017，醬香蜜酒體外抗氧化能力顯著高于原醬香型白酒，可為醬香蜜酒產(chǎn)品進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。