響應(yīng)面法優(yōu)化西藏金耳多糖提取工藝研究

張家晨，秦良云，劉怡，賈福晨，劉振東，薛蓓

（西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000）

金耳（Tremella aurantialba），俗稱腦耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門，銀耳目、銀耳科、銀耳屬，主要分布于中國云貴高原、四川、湖北、山西、江西、福建、西藏等地，西藏雖然含有豐富的野生金耳，但由于地理原因，很少被開發(fā)利用[1]。金耳作為一種營養(yǎng)食品，不僅含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)、活性多糖、維生素和蛋白質(zhì)，而且還含有特殊的抗癌活性物質(zhì)[2]。據(jù)研究，金耳干品含蛋白質(zhì)7.5%～9.5%，脂肪1.7～2.9%，碳水化合物66.9%，含糖量 14.38%，纖維 2.6%，灰分 3.44～3.5%[3-5]，并含有對人體重要的微量元素，如硒和鍺等。因此被人們當(dāng)作一種重要的天然保健品和稀有的珍貴藥食用真菌[6-7]。傳統(tǒng)中藥和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：金耳具有化痰止咳、定喘調(diào)氣、滋陰潤肺、治虛勞、肺結(jié)核等的作用[8]，提高造血機能，治療心腦血管疾病和保護肝臟，能提高機體免疫力[9]。

金耳中重要的功能成分——金耳多糖的開發(fā)具有極高的開發(fā)利用價值。目前，金耳多糖[10-11]控制血糖，預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥、高血脂、高血壓以及抗腫瘤等功能已經(jīng)開始被部分學(xué)者所研究，隨著對金耳多糖功能的進一步了解，金耳的食用、藥用價值將會被更好的發(fā)現(xiàn)和利用[12]。在《本草綱目》中，李時珍曾對金耳有過這樣的評價：“其金黃色者可致癖飲積聚，腹痛金瘡”，歷來被認(rèn)為具有重要的醫(yī)療、保健價值，被視為“補益身心”、“轉(zhuǎn)弱為強”、“延年益壽”的補品[13]。隨著國內(nèi)學(xué)者對金耳的關(guān)注度越來越高，在生產(chǎn)技術(shù)和基礎(chǔ)研究方面取得的一定進展[14]，金耳的食藥用價值將會在食品工業(yè)中具有重要價值。

水提醇沉法是目前比較受歡迎的一種方法[15]，其方法相對簡易、成本較低、操作過程成熟可靠，且一般不會導(dǎo)致提取過程中多糖的降解等變化，故本次試驗采取水提醇沉法對林芝金耳多糖進行浸提。預(yù)試驗采取料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提次數(shù)和醇沉?xí)r間5個因素來探究這些因素對金耳多糖提取率的影響，發(fā)現(xiàn)浸提次數(shù)與醇沉?xí)r間對金耳提取的影響并不是很大，所以本試驗采用料液比、浸提溫度和浸提時間3個單因素，以此對林芝金耳多糖進行浸提[16-18]，探究林芝金耳多糖的提取工藝的條件，并運用響應(yīng)面法進行優(yōu)化，旨在為林芝金耳多糖的生產(chǎn)技術(shù)和基礎(chǔ)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

金耳：于西藏林芝地區(qū)，經(jīng)西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)工程實驗室粉碎，過100目篩后備用。葡萄糖：西隴化工股份有限公司；丙酮、無水乙醇、濃硫酸、苯酚（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

BSA124S型電子天平：北京楚齊儀表有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京海天友誠科技有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；UV-2102PCS紫外分光光度計：上海恒磁電子科技有限公司；TD5A臺式低速離心機：上海重逢科學(xué)儀器有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司；KC-100A數(shù)碼超聲波清洗機：深圳市潔匯超聲洗凈設(shè)備有限公司；UPH-II-10L超純水機：濟南顧馳生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金耳多糖的提取工藝路線

金耳→烘干→磨粉→稱取粉末→單因素試驗→響應(yīng)面法優(yōu)化工藝→多糖浸提液→乙醇沉淀→檢測多糖含量。

1.2.2 多糖得率的計算

1.2.3 金耳多糖含量的測定

對金耳多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法。具體操作方法詳見參考文獻[19-20]。

1.2.4 熱水浸提林芝金耳多糖的單因素試驗

1.2.4.1 料液比對多糖提取率的影響

精確稱取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，設(shè)定浸提時間為 3 h，浸提溫度為 60℃，選取 1∶20、1 ∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）的料液比對林芝金耳進行浸提，考察不同料液比對林芝金耳多糖提取率的影響。

1.2.4.2 浸提溫度對多糖提取率的影響

精確稱取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，設(shè)定料液比為 1 ∶40（g/mL），浸提時間為 3 h，選取 40、50、60、70、80℃為提取溫度，對林芝金耳進行浸提，考察不同浸提溫度對林芝金耳多糖提取率的影響。

1.2.4.3 浸提時間對多糖提取率的影響

精確稱取2.000 g干燥的林芝金耳粉末，設(shè)定料液比為 1∶40（g/mL），浸提溫度為 60 ℃，選取 1、2、3、4、5 h為浸提時間，對林芝金耳進行浸提，考察不同浸提時間對林芝金耳多糖提取率的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗，選取料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時間（X3）這3個因素，采用三因素三水平的Box-Behnken法進行試驗設(shè)計，試驗自變量因素及水平編碼如表1。

表1 Box-Behnken方案設(shè)計的因素及水平Table 1 Factors and levels of box-behnken scheme design

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗采用Design Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對提取率的影響

料液比對提取率的變化關(guān)系見圖1。

圖1 料液比對提取率的變化關(guān)系Fig.1 Relationship between the ratio of solid to liquid and the extraction rate

從圖1可以看出，隨著料液比的增加，在1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）的范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)上升狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著料液比的增加而增加，在1 ∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)下降狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著料液比的增加而降低。其他條件一定，料液比為1∶40（g/mL）的時候，曲線出現(xiàn)峰值，多糖的提取率達到最大。

2.1.2 浸提溫度對提取率的影響

浸提溫度對提取率的變化關(guān)系見圖2。

圖2 浸提溫度對提取率的變化關(guān)系Fig.2 Relationship between extraction temperature and extraction rate

從圖2中的曲線表明，隨著浸提溫度的增加，在40℃～60℃范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)上升狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著浸提溫度的增加而增加，在60℃～80℃范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)下降狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著浸提溫度的增加而降低。其他條件一定，浸提溫度為60℃的時候，多糖的提取率達到最大。

2.1.3 浸提時間對提取率的影響

浸提時間對提取率的變化關(guān)系見圖3。

圖3 浸提時間對提取率的變化關(guān)系Fig.3 Relationship between extraction time and extraction rate

從圖3可以看出，隨著浸提時間的增加，在1 h～3 h范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)上升狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著浸提時間的增加而增加，在3 h～5 h范圍內(nèi)，曲線呈現(xiàn)下降狀態(tài)，表明多糖的提取率在此范圍內(nèi)隨著浸提時間的增加而降低。其他條件一定，浸提時間為3 h的時候，多糖的提取率達到最大。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗分析

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計綜合優(yōu)化試驗表1，分別設(shè)置自變量為料液比X1、浸提溫度X2、浸提時間X3，響應(yīng)值Y為所得提取率，響應(yīng)面設(shè)計為三因素三水平，結(jié)果如表2。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Test design and results

2.2.2 建模與顯著性考察

基于本次試驗所得數(shù)據(jù)，以金耳多糖的提取率為Y值，對自變量編碼的X1（料液比）、X2（浸提溫度）、X3（浸提時間）進行回歸分析并建立模型，得到以下回歸方程：

為了驗證回歸模型與因素的顯著性，將試驗數(shù)據(jù)運用軟件Design-Expert 8.0進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，方差分析結(jié)果如表3。

表3 方差分析表Table 3 Anova table

由表3可知，該試驗的模型P＜0.01，表明本試驗?zāi)Ｐ偷幕貧w方程的顯著性檢驗結(jié)果是可靠的。其次，失擬項P＞0.05，表明失擬項并未顯著影響試驗結(jié)果。極差R2的值為87.09%＞85%，說明該模型有著良好的擬合程度且試驗較為準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)無嚴(yán)重誤差。并且從下表中還可以看出X1（料液比）、X2（浸提溫度）、X3（浸提時間）對多糖提取率的影響程度依次為X1＞X3＞X2，除此之外，從 X1X2、X12、X22、X32的 P 值可以認(rèn)為，它們極顯著地影響多糖提取率；而X1、X3的P值介于0.01與0.05之間，可以認(rèn)為它們顯著地影響多糖提取率。綜合以上的分析，結(jié)果說明各個試驗因素與響應(yīng)值之間有著較為復(fù)雜的關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面法分析各因素間交互作用

圖4～圖6中反映的是料液比、浸提溫度、浸提時間的交互效應(yīng)之間的關(guān)系。

圖4 料液比（X1）和浸提溫度（X2）交互作用的影響Fig.4 Effects of feed-liquid ratio（X1）and extraction temperature（X2）interaction

圖5 料液比（X1）浸提時間（X3）交互作用對的影響Fig.5 Effects of feed-liquid ratio（X1）and extraction time（X3）interaction

圖6 浸提溫度（X2）浸提時間（X3）交互作用的影響Fig.6 Effects of extraction temperature（X2）and extraction time（X3）interaction

圖4反映出料液比（X1）和浸提溫度（X2）的交互效應(yīng)對林芝金耳多糖的提取率具有較為明顯的影響，在后續(xù)試驗中，可以同時適當(dāng)?shù)恼{(diào)整料液比和浸提溫度，以期提高金耳多糖的提取率。并且從圖4的平面等高線可以看出，X1方向上曲線的坡度變化較X2方向上曲線的坡度大，說明在料液比（X1）和浸提溫度（X2）的交互效應(yīng)中，料液比（X1）對金耳多糖的提取率影響更大。

由圖5可知，X1方向上曲線的坡度變化較X3方向上曲線的坡度大，說明在料液比（X1）和浸提時間（X3）的交互效應(yīng)中，料液比（X1）對金耳多糖的提取率影響更大。

由圖6可知，X2和X3方向上的曲線近似一個圓形，說明浸提溫度（X2）和浸提時間（X3）的交互效應(yīng)對對金耳多糖提取率的影響并不明顯。

2.2.4 優(yōu)化工藝驗證試驗結(jié)果

為獲得最佳的提取工藝，繼續(xù)采用Design-Expert 8.0對上述模型進行進一步分析，所得結(jié)果如下：料液比1∶40.6（g/mL），浸提溫度 59.78℃，浸提時間 3.09 h。預(yù)測金耳多糖的最大提取率是8.020 08%。考慮到試驗的可操作性和可行性，選取料液比1∶41（g/mL），浸提溫度60℃，浸提時間3 h，測得金耳多糖的提取率為7.9%（進行了3次重復(fù)試驗），此提取率與模型預(yù)測的金耳多糖最大的提取率8.020%，相比較結(jié)果相符合。說明用響應(yīng)面來優(yōu)化林芝金耳多糖的工藝條件是具有實際操作性的。

3 結(jié)論與討論

本次試驗為探究浸提溫度、浸提時間、料液比3個因素以及兩兩因素間交互效應(yīng)對林芝金耳多糖提取率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化研究得出了最優(yōu)的提取條件：料液比1∶41（g/mL），浸提溫度60℃，浸提時間3 h，并且在此工藝條件下進行3次驗證試驗，得出的金耳多糖的提取率為7.9%，該結(jié)果與模型預(yù)測的結(jié)果8.020%大致符合，表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化金耳多糖熱水浸提的工藝條件是具有實際操作性的。在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面分析的試驗結(jié)果還表明：試驗選取的各因素（料液比、浸提時間、浸提溫度）對多糖提取率的影響大小從大到小依次為料液比＞浸提時間＞浸提溫度。且在交互效應(yīng)對金耳多糖提取率的影響中，料液比與浸提溫度的交互效應(yīng)對金耳多糖提取率的影響最大。此外，本次試驗只探究了上述3個因素與林芝金耳多糖提取率變化關(guān)系，部分相關(guān)工藝如醇沉、浸提，或所用溶劑濃度也會影響試驗結(jié)果，所以未來研究者為得出最佳的熱水浸提工藝，可以進一步探究上述因素對林芝金耳多糖提取的影響，為林芝金耳多糖的生產(chǎn)技術(shù)和基礎(chǔ)性研究提供了一定的理論依據(jù)。