熱處理對卵白蛋白理化性質及其ACE抑制活性的影響

張曉，楊鋒，趙笑蕾

（廣西科技大學，廣西柳州545006）

雞蛋清中含有豐富的蛋白質，其中包括卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、卵轉鐵蛋白、卵類黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶和卵球蛋白等蛋白質組分，而最主要的卵白蛋白約占總蛋白的50%以上。卵白蛋白是一種由385個氨基酸組成，等電點為4.5，變性溫度為84℃，分子質量約為45 kDa的單一肽鏈折疊形成的磷糖球蛋白[1]。血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種分子量為170 kDa的糖蛋白，是調節(jié)人體血壓的一種關鍵酶[2]。ACE在調節(jié)血壓中具有雙重作用，它能將無催化活性的血管緊張素Ⅰ轉化為具有活性的血管緊張素Ⅱ，同時還能使舒緩激肽（降壓物質）失活，從而導致血壓升高[3]。程緣等[4]通過脫鹽、超濾處理卵白蛋白源ACE抑制肽并對其ACE抑制活性及理化性質進行了研究，在超濾時間為40 min、操作壓力為1.5 bar、溫度為30℃的條件下測得的ACE抑制活性最高。Gül Akllllogˇlu等[5]通過不同時間的熱處理來探究3種豆科類植物蛋白中ACE抑制活性的變化，結果表明，在121.1℃條件下處理50 min時，3種豆類蛋白中ACE抑制活性均有明顯的提高。Elizabeth等[6]對火腿中多肽的ACE抑制活性進行了熱處理研究，在117℃下處理6 min時得到的ACE抑制活性較高。

因此本文在不同溫度下對卵白蛋白進行熱處理，研究熱處理對卵白蛋白理化性質的影響，并采用堿性蛋白酶來酶解熱處理后的卵白蛋白，探究其水解度及ACE抑制活性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋：市售；聚乙二醇 4000（polyethylene glycol，PEG）：天津市大茂化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1-苯胺-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、5，5'二硫代雙（2-硝基 苯 甲 酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、對苯二甲酸、過硫酸銨、丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R250、茚三酮：阿拉丁試劑有限公司；堿性蛋白酶（20萬U/g）：龐博生物工程有限公司；血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、馬尿酰組胺酰亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）：美國Sigma公司；其它試驗所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器

Nano ZS90納米粒度、Zeta電位分析儀：英國Malvern公司；Bio-rad電泳系統(tǒng)：美國Bio-rad公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；HSS-1型恒溫水槽：成都儀器廠；F-320熒光分光光度計：天津港東科技股份有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取卵白蛋白

取新鮮的雞蛋分離出蛋清，并用紗布過濾其中的絮狀物得到干凈的蛋清液。參考聞崇煒等[7]方法，在室溫（25℃）條件下取一定量蛋清液用去離子水稀釋2倍，并調其pH值至7.5，于9 500 r/min離心20 min，取上清液Ⅰ，攪拌并加入質量分數為50%的聚乙二醇4000（polyethylene glycol，PEG）直至其質量分數為總溶液的12%，于9 500 r/min離心20 min，取上清液Ⅱ，并調其pH值至5.5，于9 500 r/min離心20 min，再加入質量分數為50%的PEG 4000直至其質量分數為總溶液的24%，于9 500 r/min離心20 min，得到的沉淀即為卵白蛋白，凍干備用。

1.3.2 熱處理卵白蛋白

將OVA樣品配置為3%的分散液，采用水浴加熱裝置分別在室溫（25℃）、60、70、80、90℃條件下對OVA樣品溶液處理10 min，將裝有處理后OVA樣品溶液的燒杯立即放置于冰水中冷卻至室溫（25℃）。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

配置濃度為13%的分離膠和濃度為4%的濃縮膠。將OVA樣品稀釋至濃度為3 mg/mL，取30 μL稀釋后的OVA樣品溶液加入60 μL的樣品緩沖液，混合均勻后在95℃條件下加熱5 min，冷卻后上樣。電泳時OVA樣品在濃縮膠中電流為16 mA，進入分離膠后將電流調為28 mA，電泳結束后，取出凝膠并倒入固定液在加熱煮沸條件下固定5 min～6 min，然后倒入染色液在加熱煮沸條件下染色5 min～6 min，在加熱煮沸條件下進行脫色直至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶為止，最后使用凝膠成像系統(tǒng)進行成像處理。

1.3.4 粒徑和Zeta電位的測定

通過Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀來測定OVA樣品的平均粒徑和Zeta電位。將處理好的OVA樣品溶液，選擇Size測量軟件在25℃的條件下測量，并取3次測量的平均值。再選擇Zeta電位測量軟件測量，取一個間距為0.4 cm并帶有一對0.45 cm2鉑電極的1 cm的聚苯乙烯樣品池，在25℃的條件下平衡2 min，測量3次并取平均值。

1.3.5 巰基含量的測定

參考雷莉等[8]的試驗方法，將OVA樣品稀釋至濃度為4 mg/mL，并取2 mL稀釋好的OVA樣品溶液加入5 mL的測試液（pH 8.0的Tris-Gly緩沖液用于測定暴露巰基含量；Tris-Gly-8Murea溶液用于測定總巰基含量），加入100μL4mg/mL的5，5'二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB） 溶液，在25℃恒溫振蕩器條件下振蕩1 h后，于9 000 r/min離心10 min，取2 mL的去離子水中加入5 mL測試液及100 μL DTNB作為空白對照，并在412 nm處測定其吸光度值，按如下公式測定巰基含量：

式中：A412為除去試劑對照后加入DTNB樣品的吸光度值；A1為除去試劑對照后不加入DTNB樣品的吸光度值；C為蛋白濃度；D為稀釋倍數；73.53為106/（1.36×104）。

1.3.6 內源熒光光譜的測定

參考Jiang等[9]的試驗方法，采用熒光分光光度計對OVA樣品溶液進行測定，設置其激發(fā)波長為290nm，掃描發(fā)射波長范圍為300 nm～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，電壓為600 V。

1.3.7 表面疏水性的測定

參考Yin等[10]的試驗方法，以1-苯胺-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 為熒光探針，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 8.0）將OVA樣品溶液稀釋至不同濃度（0.48 mg/mL～2.4 mg/mL），分別取不同濃度的OVA樣品溶液4 mL加入10 μL濃度為8 mmol/L的ANS，混合均勻后，在熒光分光光度計下測定，設定其激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長480 nm，狹縫寬為5 nm，電壓為600 V。以熒光強度對蛋白濃度作圖并進行線性回歸，并以線性回歸斜率作為蛋白質的表面疏水性。

1.3.8 酶解卵白蛋白

參考黃群等[11]的試驗方法，取一定量的1.2%OVA樣品溶液，添加酶量為0.2%（以水解溶液重量計算），調其pH 8.5，在45℃條件下酶解3 h，酶解后加熱到80℃滅酶10 min，即得到酶解溶液。

1.3.9 水解度的測定

采用茚三酮顯色法[12]來測定其水解度。取酶解蛋白液0.1 mL定容至10 mL，取0.2 mL稀釋液于試管中加入0.8 mL蒸餾水、1.0 mL顯色劑，混勻后放入沸水浴中加熱15 min，同時作空白試驗。待溶液冷卻后加入5.0 mL 40%的乙醇溶液混勻，靜置15 min后在570 nm波長下測其吸光度。根據標準曲線計算出酶解前后中游離氨基的含量，并采用微量凱氏定氮法測定卵白蛋白中氨基酸的總量。水解度按下式計算：

1.3.10 ACE抑制活性的測定

參考Cushman等[13]的試驗方法來測定ACE抑制活性，吸取25 μL酶解后的OVA樣品溶液作為抑制劑，加到100 μL 5 mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL）中，于 37℃水浴中加熱 5 min；立即加入 25 μL ACE啟動反應，再于37℃水浴中加熱30 min，反應結束后，加入100 μL 1 mol/L的HCl終止反應；再向試管中加入1.9 mL的乙酸乙酯，于4 000 r/min離心10 min，吸取1 mL的酯層于100℃烘箱內蒸干，取出冷卻后將其重新溶解于3 mL的去離子水中，在波長228 nm處測定吸光度值。具體計算公式如下：

式中：Aa為反應中ACE抑制劑及ACE同時存在的吸光度值；Ab為反應中不加入ACE抑制劑的吸光度值；Ac為ACE和HHL空白反應的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 卵白蛋白純度分析

卵白蛋白電泳圖譜見圖1。

通過對SDS-PAGE電泳圖進行光密度分析，卵白蛋白的純度達到95%以上。

2.2 熱處理對卵白蛋白粒徑的影響

熱處理對卵白蛋白粒徑分布的影響見圖2；熱處理對卵白蛋白平均粒徑的影響見圖3。

圖1 卵白蛋白電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of ovalbumin

圖2 熱處理對卵白蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of heat treatment on particle size distribution of ovalbumin

圖3 熱處理對卵白蛋白平均粒徑的影響Fig.3 Effect of heat treatment on average particle size of ovalbumin

由圖2可知，室溫（25℃）下的卵白蛋白粒徑呈兩個峰分布，其中一個峰分布在0～10 nm處，另一個峰分布在100 nm～1 000 nm處，這與李弓中等[14]所研究的蛋清蛋白粒徑分布基本相似。與處理前相比，當處理溫度為60℃時，0～10 nm處的峰強度減弱，100 nm～1000 nm的峰強度增強；處理溫度為70℃時，0～10 nm和100 nm～1 000 nm處的峰強度均減弱，且100 nm～1 000 nm處的峰向右偏移；處理溫度為80℃和90℃時，0～10 nm處的峰強度均增強，100 nm～1 000 nm處的峰強度均減弱，且100 nm～1 000 nm處的峰都向左偏移。由圖3可以看出，與處理前相比，熱處理60℃和70℃時的平均粒徑顯著增大（P＜0.05），由（622.73±4.60）nm增大到（1 527.00±59.40）nm，當熱處理溫度為80℃和90℃時的平均粒徑顯著減?。≒＜0.05），減小至（261.64±2.26）nm。平均粒徑增大的原因是因為隨著溫度的升高，卵白蛋白開始發(fā)生聚集，從而增大了粒徑。80℃和90℃時平均粒徑減小的原因可能是因為溫度接近或超過卵白蛋白的變性溫度，蛋白質分子吸收熱能運動加劇，分子間的接觸與交聯(lián)機會增加，通過疏水作用結合成為了可溶聚集體[15-16]，在較高溫度下聚集體發(fā)生解離，從而導致平均粒徑減小。

2.3 熱處理對卵白蛋白Zeta電位的影響

熱處理對卵白蛋白Zeta電位的影響見圖4。

圖4 熱處理對卵白蛋白Zeta電位的影響Fig.4 Effect of heat treatment on Zeta potential of ovalbumin

Zeta電位是判斷一個體系是否穩(wěn)定的重要因素，電位的絕對值越大，代表體系越穩(wěn)定，電位為負數時，說明蛋白質表面帶負電荷的氨基酸比較多，若為正數，則相反[17]。由圖4可以看出，與處理前相比，當處理溫度為60℃時，Zeta電位變化不明顯，當處理溫度為70、80和90℃時，Zeta電位絕對值顯著增大（P＜0.05），由（6.56± 0.36）mV 增大到（19.20± 0.62）mV。這可能是因為隨著溫度的升高，卵白蛋白發(fā)生變性，導致疏水基團暴露出來，在靜電作用和疏水作用下形成了聚集體，帶電的氨基酸排布在聚集體表面，使Zeta電位的絕對值增大。Yanqiu Ma等[18]在75℃干熱處理卵白蛋白，Zeta電位由開始的-17.03 mV降至-19.77 mV，Zeta電位的絕對值增大，與本文結果相似。

2.4 熱處理對卵白蛋白巰基含量的影響

熱處理對卵白蛋白表面巰基含量的影響見圖5；熱處理對卵白蛋白總巰基含量的影響見圖6。

圖5 熱處理對卵白蛋白表面巰基含量的影響Fig.5 Effect of heat treatment on surface sulfhydryl（SH）group content of ovalbumin

圖6 熱處理對卵白蛋白總巰基含量的影響Fig.6 Effect of heat treatment on total sulfhydryl（SH）group content of ovalbumin

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，卵白蛋白的表面巰基含量不斷增加，當熱處理溫度為60℃時，表面巰基含量增加不顯著（P＞0.05），處理溫度為 70、80、90℃時，表面巰基含量增加的效果顯著（P＜0.05），由（2.20±0.37）μmol/g增加到（23.76±0.71）μmol/g，這是因為熱處理能使卵白蛋白分子展開，使內部的巰基暴露出來，導致表面巰基含量增加。圖6則是熱處理對卵白蛋白總巰基含量的影響，由圖6可以看出，當處理溫度為60、70、80℃時，總巰基含量減少，由（9.63±0.26）μmol/g減少到（6.46±0.16）μmol/g。當處理溫度達到90℃時，總巰基含量顯著增多（P＜0.05），增至（29.55±1.88）μmol/g?？値€基含量降低的原因可能是因為試驗是在有氧條件下進行的，使部分巰基二硫鍵之間發(fā)生相互轉換，從而導致總巰基含量減少。而90℃時總巰基含量增加的原因可能是由于溫度超過卵白蛋白的變性溫度，導致蛋白質構象改變，部分二硫鍵斷裂生成巰基。Matsudomi等[19]在80℃干熱條件下處理卵白蛋白，表面巰基含量增加，總巰基含量減少，與本文80℃前處理卵白蛋白的結果一致。

2.5 熱處理對卵白蛋白內源熒光光譜的影響

熱處理對卵白蛋白內源熒光光譜的影響見圖7。

圖7 熱處理對卵白蛋白內源熒光光譜的影響Fig.7 Effect of heat treatment on intrinsic emission fluorescence spectra of ovalbumin

熒光光譜具有高靈敏性，是一種被廣泛應用于研究蛋白質三級結構變化的重要手段[20]。由于蛋白質的熒光光譜是由色氨酸的化學環(huán)境決定的，因此色氨酸光學性質的變化常被用于考察蛋白質構象的變化[21]。當色氨酸向親水環(huán)境遷移時，內源熒光光譜最大吸收峰會向長波長方向轉移（紅移）；當色氨酸向疏水環(huán)境遷移時，內源熒光光譜最大吸收峰會向短波長方向移動（藍移）；若最大吸收峰沒有發(fā)生偏移，只有熒光峰信號的減弱或者增強，則不能作為判斷蛋白質構象發(fā)生明顯改變的依據[22]。如圖7所示，與處理前相比，隨著溫度的增加熒光強度也不斷增強，但卵白蛋白的最大吸收峰只有在80℃和90℃時從340 nm遷移到339 nm。這可能是因為在較高溫度的處理下使蛋白質聚集，色氨酸的微環(huán)境變得更加疏水。Nicoleta等[23]在pH 4.5的條件下對卵白蛋白進行熱處理，隨著溫度的增加熒光強度也隨之增強，在加熱到90℃時，蛋白樣品的最大吸收峰發(fā)生2 nm藍移；Yanqiu Ma等[18]經干熱處理后的卵白蛋白，熒光強度隨著加熱時間的延長而增大，蛋白樣品的最大吸收峰發(fā)生了明顯的藍移，均與本試驗研究結果一致。

2.6 熱處理對卵白蛋白表面疏水性的影響

熱處理對卵白蛋白表面疏水（H0）的影響見圖8。

圖8 熱處理對卵白蛋白表面疏水（H0）的影響Fig.8 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity（H0）of ovalbumin

由圖8所示，與處理前相比，當熱處理溫度為60℃和70℃時，卵白蛋白的表面疏水性值增大，由（249.52±0.49）增大至（274.32±1.19）。這是因為熱處理誘導蛋白分子展開，使埋藏在蛋白分子內部的疏水基團暴露，與ANS熒光探針的結合位點增多，進而導致蛋白質的H0增加。而當熱處理溫度為80℃和90℃時，卵白蛋白的表面疏水性值顯著降低（P＜0.05），由（274.32±1.19）降至（135.17±14.81）。這是因為溫度接近或超過卵白蛋白的變性溫度，已經展開的蛋白分子通過疏水作用又重新結合起來，使暴露出來的疏水基團被重新埋藏于分子內部[15]，進而導致表面疏水性值降低。陶汝青等[24]研究了熱處理對大豆分離蛋白結構的影響，結果表明，隨著加熱時間的延長，其表面疏水性先增加后降低，與本文結果相符。

2.7 熱處理對卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的影響

熱處理對卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的的影響見圖9。

圖9 熱處理對卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的的影響Fig.9 Effect of heat treatment on degree of hydrolysis and ACE inhibition activity of ovalbumin

由圖9所示，與處理前相比，當溫度為60℃時，水解度由（22.42±0.83）%增加到（28.62±0.42）%，而隨著溫度的增加，卵白蛋白的水解度出現(xiàn)下降趨勢。水解度增加的原因是因為加熱后的卵白蛋白分子結構疏松，使蛋白水解酶的作用點增加，卵白蛋白更容易被酶解，所以水解度出現(xiàn)上升趨勢。而水解度下降的原因是由于溫度過高，蛋白質分子發(fā)生不同程度的聚集，內部基團被重新包裹，松散的多肽鏈又會重新結合起來，這樣反而阻礙了酶對蛋白的水解[25]，導致水解度下降。隨著熱處理溫度的升高，ACE抑制活性有不同程度的增大，80℃時的抑制活性能達到（79.17±0.54）%。由圖9可知，卵白蛋白的水解度與其ACE抑制活性并沒有表現(xiàn)出嚴格的線性關系，即水解度高并不意味著ACE抑制活性也一定高，這與范遠景等[26]用5種不同的蛋白酶酶解大豆分離蛋白所得到的結果是一致的。

3 結論

本試驗通過熱處理對卵白蛋白的理化性質及酶解后蛋白的水解度和ACE抑制活性進行了研究。結果表明，當熱處理溫度為80℃時，ACE抑制活性較高，此條件下蛋白的理化性質與處理前蛋白的理化性質相比，平均粒徑減小，表面巰基含量增加但總巰基含量降低，表面疏水性降低，熒光強度增加且最大吸收峰發(fā)生藍移。由此可見，熱處理能有效地改變蛋白質的理化性質，這可能使堿性蛋白酶的作用位點在一定程度上發(fā)生遷移，進而導致酶解后卵白蛋白的ACE抑制活性發(fā)生了改變。