料水比對農(nóng)業(yè)廢棄物稻草和豬糞生物預(yù)處理及厭氧消化的影響

鐘 斌，沈 飛，李漢廣，夏 祥，王艷玲，張慶華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌330045）

【研究意義】中國是一個(gè)傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，每年生產(chǎn)糧食產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈約8億t，畜禽糞便干物質(zhì)量高達(dá)3.3億t[1]。迄今為止，大多數(shù)秸稈和畜禽糞便的處置方式仍然是直接焚燒或排入水體。秸稈的焚燒不僅會(huì)造成空氣污染，而且會(huì)破壞土壤表層的微生物生長環(huán)境，使土壤的營養(yǎng)流失，肥力下降[2]。隨意排放的畜禽糞便在厭氧環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生多種有毒有害物質(zhì)，危害人體健康。反之，如果利用得當(dāng)，這些農(nóng)業(yè)廢棄物可轉(zhuǎn)廢為寶形成巨大的經(jīng)濟(jì)效益。為此，開發(fā)與探索新的處置方法是提高當(dāng)前農(nóng)業(yè)廢棄物利用率的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外對利用農(nóng)作物秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷的研究比較多[3-6]，而畜禽糞便則主要用作有機(jī)肥[7]。有研究[8]嘗試將畜禽糞便進(jìn)行單一的厭氧消化，然而由于畜禽糞便碳氮比較低，單一地將其進(jìn)行厭氧消化會(huì)導(dǎo)致氨氮含量過高從而對厭氧消化產(chǎn)生抑制[9]。因此有學(xué)者[10-12]根據(jù)農(nóng)作物秸稈高碳氮比和畜禽糞便低碳氮比的特性將二者進(jìn)行厭氧共消化，取得了不錯(cuò)的效果。然而，秸稈中含有大量的纖維質(zhì)，纖維質(zhì)分子內(nèi)部有復(fù)雜的分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)，可以有效阻止纖維質(zhì)被降解[13]，這是制約農(nóng)作物秸稈厭氧消化的主要因素之一。由于纖維質(zhì)的難降解性，目前利用秸稈來進(jìn)行的厭氧消化大都需要對秸稈進(jìn)行預(yù)處理，常見的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法[14]和生物法[15-16]。雖然物理和化學(xué)預(yù)處理方法可以提高秸稈的消化效率，但是二者都需要額外的耗材且易產(chǎn)生二次污染，因而很少用于農(nóng)業(yè)廢棄物的預(yù)處理。相比之下，生物預(yù)處理以其不消耗額外試劑，能耗低，處理?xiàng)l件溫和等優(yōu)勢，逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。生物預(yù)處理又分為單一菌株的預(yù)處理和復(fù)合菌系預(yù)處理，與單一菌株的預(yù)處理相比，復(fù)合菌系的預(yù)處理依靠微生物間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)對纖維質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化，可以分泌多種酶系對不同的底物都有較好的降解效果，并且對環(huán)境依賴性不高[17]。近年來，采用復(fù)合菌系對農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行生物預(yù)處理受到學(xué)者廣泛關(guān)注。【本研究切入點(diǎn)】纖維質(zhì)的降解效果能顯著影響厭氧消化，而影響復(fù)合菌系降解纖維質(zhì)活性的因素有料水比、接種量、預(yù)處理時(shí)間等[18]。就料水比而言，料水比過高會(huì)使得環(huán)境中的營養(yǎng)成分難以被微生物攝取，水解生成的某些毒性物質(zhì)不易被稀釋，從而導(dǎo)致微生物生長受到抑制；過低的料水比降低了發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，使得微生物營養(yǎng)不足，不能充分利用反應(yīng)器的空間，造成水解效率低下[19-20]。因此，探究出一個(gè)合適的料水比進(jìn)行生物預(yù)處理對厭氧消化效率的提高有著重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】目前關(guān)于料水比對復(fù)合菌系預(yù)處理以及后續(xù)厭氧消化效果影響鮮見報(bào)道，本研究以農(nóng)業(yè)廢棄物豬糞稻草為原料，以前期定向構(gòu)建的纖維素降解復(fù)合菌系[21]為預(yù)處理手段，將預(yù)處理后的稻草和豬糞作為底物進(jìn)行厭氧消化，探究不同料水比條件下經(jīng)過生物預(yù)處理后的稻草和豬糞聯(lián)合厭氧消化的產(chǎn)氣特性，以期為農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用提供新的方向。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

稻草于2017年6月取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田早稻秸稈，秸稈風(fēng)干后粉碎備用；豬糞取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院生豬養(yǎng)殖場；厭氧污泥取自新余羅坊沼氣站。上述研究材料及接種物的基本性質(zhì)如表1所示，本試驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間為2017年10月到2018年1月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，NaCl 5 g，CaCO30.9 g，濾紙5 g，豬糞1.8 g，蒸餾水1 L，pH 7.6，滅菌備用。

1.2.2 復(fù)合菌系的活化 將前期篩得的纖維素降解復(fù)合菌系以10%（V/V）的接種量接種至活化培養(yǎng)基，于55℃的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)36 h。

1.2.3 復(fù)合菌系預(yù)處理 控制C/N比為30∶1，稱取總質(zhì)量為9.9 g的稻草和豬糞，按照7%、11%、15%、19%的料水比（W/V）加入不同體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.6，以10%的接種量（V/V）添加活化好的菌液，于55℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)30 h。上述預(yù)處理操作均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。預(yù)處理結(jié)束后以8 000 r/min離心10 min取上清測定其中的濾紙酶活、CMC酶活（carboxymethy cellulose enzyme activity）、化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）等參數(shù)。

1.2.4 厭氧消化 取300 mL厭氧污泥，加入預(yù)處理好的稻草和豬糞混合物（包括發(fā)酵液及殘?jiān){(diào)節(jié)pH至7.2，密封后通3 min氮?dú)庖猿テ恐醒鯕猓冢?5±1）℃恒溫水浴鍋中靜置培養(yǎng)，每12 h手動(dòng)搖晃藍(lán)口瓶1 min使瓶中反應(yīng)物混合均勻，以未經(jīng)復(fù)合菌系預(yù)處理的稻草和豬糞混合物作為對照組底物重復(fù)以上操作。以上厭氧消化設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)取300 mL污泥且不加稻草和豬糞進(jìn)行厭氧消化，以排除污泥自身產(chǎn)氣的干擾。用排NaOH法收集氣體以測定甲烷產(chǎn)量[21]，停止產(chǎn)氣后，將發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min取上清測定其中的還原糖、氨氮、堿度等參數(shù)。

表1 試驗(yàn)材料的基本性質(zhì)Tab.1 Basic properties of experimental materials

1.3 分析方法

TS、VS、COD的測定參照APHA方法[22]；使用雷磁PHS-3C pH計(jì)測定pH；使用排NaOH法測定產(chǎn)氣量[21]；總有機(jī)碳的測定采用馬弗爐灰化法[23]；氨氮的測定采用靛酚藍(lán)反應(yīng)法[24]；總氮的測定采用凱氏定氮法[23]；使用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定還原糖的含量[24]；堿度的測定采用溴甲酚綠-甲基紅指示劑滴定法[25]；有機(jī)酸采用比色法測定[25]；濾紙酶活和CMC酶活見參考文獻(xiàn)[21]；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的測定采用范式洗滌法[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)處理均使用軟件Origin 9.1處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 料水比對稻草和豬糞預(yù)處理過程關(guān)鍵酶酶活的影響

有研究顯示，復(fù)雜底物的生物可降解性和沼氣潛力取決于可生物降解的碳水化合物（包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分）的含量[27]，纖維質(zhì)的水解階段是厭氧消化的限速步驟[28]，Dai等[29]的研究表明纖維素酶活在纖維質(zhì)水解過程中起著重要的作用。通常，用CMC酶活表示微生物對纖維質(zhì)的降解能力，而濾紙酶活代表了總木質(zhì)纖維素的降解能力[18]。由圖1可見，料水比對酶活有著顯著影響，隨著料水比的提升，CMC酶活和濾紙酶活都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)料水比控制在11%時(shí)，發(fā)酵液的濾紙酶活和CMC酶活最高，分別達(dá)到0.901 IU和1.197 IU。該結(jié)果表明11%的料水比比較適合復(fù)合菌系的預(yù)處理，這可能是由于在高料水比的環(huán)境下，復(fù)合菌系分解纖維質(zhì)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)不能被稀釋，進(jìn)而對酶活產(chǎn)生影響；而更低的料水比則會(huì)影響復(fù)合菌系吸收環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，不利于分泌酶系。

圖1 不同料水比條件下關(guān)鍵酶酶活Fig.1 Key enzyme activity under different ratio of material to water

2.2 不同料水比條件下預(yù)處理及厭氧消化中間代謝產(chǎn)物的變化

COD能反映有機(jī)物的相對含量，由圖2（a）可見，經(jīng)過36 h的預(yù)處理之后，預(yù)處理組的COD隨著料水比的提升先上升后下降，11%料水比條件下的預(yù)處理液中COD含量最高，為8 234 mg/L；經(jīng)過厭氧消化后，各料水比條件下的消化液中COD均處于3 800～4 200 mg/L。這可能是因?yàn)閰捬跸A段，產(chǎn)甲烷會(huì)消耗大量的有機(jī)物，此外，微生物生長也會(huì)消耗有機(jī)物導(dǎo)致COD的下降。

在厭氧消化的第二階段，也就是酸化階段，酸化細(xì)菌會(huì)將水解階段生成的小分子物質(zhì)如還原糖等分解成有機(jī)酸等產(chǎn)物，供產(chǎn)氫產(chǎn)酸階段使用[30]。由圖2（b）可見，預(yù)處理結(jié)束后，隨著料水比的提升，各預(yù)處理組還原糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且11%料水比條件下的預(yù)處理液中還原糖的濃度（160.76 mg/L）最高。這可能是因?yàn)樵?1%料水比條件下降解纖維質(zhì)的兩種關(guān)鍵酶酶活較高，因而能夠降解底物產(chǎn)生更多的還原糖。

不同料水比條件下預(yù)處理和厭氧消化的有機(jī)酸含量和pH如圖2（c）所示，經(jīng)過36 h的預(yù)處理后，各預(yù)處理組有機(jī)酸含量均處于1 400～2 300 mg/L，這可能是因?yàn)轭A(yù)處理過程中產(chǎn)生的還原糖等物質(zhì)會(huì)被產(chǎn)乙酸菌利用，導(dǎo)致預(yù)處理液中的有機(jī)酸含量顯著升高，其中，11%料水比條件下的預(yù)處理液有機(jī)酸含量最高，為2 270 mg/L，這可能與該料水比條件下復(fù)合菌系分泌酶的活性有關(guān)。有研究表明預(yù)處理液中的有機(jī)酸成分主要是乙酸[31]。乙酸的大量積累會(huì)使得厭氧消化的產(chǎn)氣高峰提前到來，這對縮短厭氧消化的時(shí)間有著極其重要的意義。經(jīng)過厭氧消化以后，系統(tǒng)中的有機(jī)酸被大量消耗，有研究表明系統(tǒng)中殘余的有機(jī)酸可能是丙酸，這可能是因?yàn)楸岬慕到庑枰蛰^高的自由能，無法自發(fā)進(jìn)行[32]。隨著料水比的提升，預(yù)處理組的pH先下降后上升，這與有機(jī)酸的含量有關(guān)，在11%料水比條件下，pH最低，為6.62；經(jīng)過厭氧消化后，實(shí)驗(yàn)組和對照組的pH均為7.5左右，上述結(jié)果表明整個(gè)系統(tǒng)的pH在預(yù)處理過程和厭氧消化過程均處于厭氧消化適宜的pH（6.5～8.5）。說明稻草豬糞經(jīng)過復(fù)合菌系預(yù)處理后具有較好的pH自我調(diào)節(jié)能力和穩(wěn)定性。

堿度具有中和系統(tǒng)中的有機(jī)酸防止系統(tǒng)過快酸化的作用，有研究表明，當(dāng)有機(jī)酸與堿度之比為0.5以下時(shí)，厭氧消化系統(tǒng)的系統(tǒng)穩(wěn)定性比較好[33]。由圖2（c）和（d）可見，隨著料水比的提升，各預(yù)處理組堿度普遍較低，均不高于3 200 mg/L（以CaCO3計(jì)），經(jīng)復(fù)合菌系預(yù)處理稻草和豬糞進(jìn)行厭氧消化，發(fā)酵液堿度均高于6 000 mg/L，這可能是因?yàn)閰捬跸^程利用了大量的蛋白質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)，產(chǎn)生了氨氮類物質(zhì)，使堿度上升[34]。此時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組有機(jī)酸與堿度的比值分別為0.063、0.065、0.101、0.142，仍遠(yuǎn)低于0.5，這表明經(jīng)過纖維素復(fù)合菌系預(yù)處理以后的稻草和豬糞在厭氧消化階段穩(wěn)定性較好。

氨氮是影響厭氧消化的重要因素之一，在厭氧消化過程中，氨氮主要通過降解蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)積累。有研究表明，低于200 mg/L的總氨氮對微生物的生長是有利的，因?yàn)槲⑸锟梢岳冒钡鳛樯L代謝的氮源，但是當(dāng)氨氮濃度超過1 500 mg/L時(shí)，厭氧消化將會(huì)受到抑制[35-36]。由圖2（e）可見，經(jīng)過預(yù)處理后，各預(yù)處理液中的氨氮濃度都比較低，均處于600 mg/L以下，這說明在厭氧消化初期系統(tǒng)中的氨氮不會(huì)對其造成抑制。并且在厭氧消化結(jié)束以后，各處理組的實(shí)驗(yàn)組中的氨氮濃度仍低于1 500 mg/L，說明經(jīng)過預(yù)處理后，氨氮濃度不會(huì)對厭氧消化產(chǎn)生抑制作用。

圖2 各料水比條件下發(fā)酵液的COD（a）、還原糖（b）、有機(jī)酸和pH值（c）、堿度（d）和氨氮（e）變化情況Fig.2 Changes of COD（a），reduction of Sugar（b），Organic Acid and pH Value（c），alkalinity（d）and ammonia nitrogen（e）in fermentation broth under different ratio of material to water

2.3 料水比對稻草和豬糞預(yù)處理后厭氧消化產(chǎn)甲烷的影響

有文獻(xiàn)[37]報(bào)道，不同底物進(jìn)行厭氧消化產(chǎn)甲烷通常具有兩個(gè)產(chǎn)氣高峰，不同料水比條件下的日產(chǎn)氣量如圖3（a）所示，各處理組均有兩個(gè)很明顯的產(chǎn)氣高峰，這與文獻(xiàn)所報(bào)道的結(jié)果一致。第一個(gè)產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)的可能是因?yàn)榈静莺拓i糞經(jīng)過預(yù)處理后積累了大量的可溶性有機(jī)質(zhì)，在厭氧消化時(shí)可以被甲烷菌快速利用；第二個(gè)產(chǎn)氣高峰的出現(xiàn)可能是因?yàn)轭A(yù)處理階段積累的有機(jī)質(zhì)消耗完畢后甲烷菌開始利用纖維質(zhì)等較難降解的物質(zhì)。在11%料水比條件下，經(jīng)過復(fù)合菌系預(yù)處理后的稻草豬糞進(jìn)行厭氧消化時(shí)的產(chǎn)氣峰值（153 mL），并且高峰持續(xù)時(shí)間（7d）最長。此外，經(jīng)復(fù)合菌系預(yù)處理后的稻草和豬糞進(jìn)行厭氧消化時(shí)能夠更快的進(jìn)入產(chǎn)氣高峰期，由圖3（a）可見，各實(shí)驗(yàn)組均在第1天到達(dá)產(chǎn)氣高峰，而未經(jīng)復(fù)合菌系預(yù)處理的稻草和豬糞進(jìn)行厭氧消化時(shí)均在第3天達(dá)到產(chǎn)氣高峰期，表明復(fù)合菌系預(yù)處理在縮短厭氧消化時(shí)間和提高甲烷產(chǎn)量方面有著巨大優(yōu)勢。

累積甲烷產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)率如圖3（b）和（c）所示，11%料水比條件下預(yù)處理的稻草和豬糞混合物厭氧消化后，累積甲烷產(chǎn)量為1 778 mL，甲烷產(chǎn)率為283.12 mL/（g·VS），該結(jié)果比對照組提高了41%，分別比7%、15%和19%料水比條件下的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氣提高了27.63%、30.93%和58.75%。這可能是因?yàn)樵?1%的料水比條件下，稻草和豬糞經(jīng)過復(fù)合菌系預(yù)處理累積了大量的有機(jī)酸和還原糖。上述結(jié)果表明，在11%的料水比條件下，稻草和豬糞經(jīng)復(fù)合菌系預(yù)處理后表現(xiàn)出更強(qiáng)的產(chǎn)氣潛力。

圖3 不同料水比預(yù)處理對厭氧消化產(chǎn)甲烷的影響Fig.3 Effect of pretreatment with different ratio of material to water on methane production in anaerobic digestion

3 結(jié)論

本研究以農(nóng)業(yè)廢棄物稻草和豬糞為原料，研究了不同料水比條件下經(jīng)過生物預(yù)處理后對厭氧消化的影響。結(jié)果表明，將稻草和豬糞在11%料水比條件下進(jìn)行復(fù)合菌系預(yù)處理，濾紙酶活（0.901 IU）和CMC酶活（1.197 IU）最高，經(jīng)此料水比條件下預(yù)處理后的稻草和豬糞混合物進(jìn)行的厭氧消化效果最佳，產(chǎn)氣高峰提前2d到來，高峰持續(xù)7d，甲烷產(chǎn)率高達(dá)283.12 mL/（g·VS），比對照組提高41%。表明纖維素降解復(fù)合菌系在農(nóng)業(yè)廢棄物生物處置及提高厭氧消化產(chǎn)甲烷方面具有極大的應(yīng)用潛力。