虎掌南星加工炮制一體化工藝優(yōu)化

曹淼淼，朱建光，張振凌，孟 冉，李小玉

（河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州450008）

虎掌南星Pinellia pedatisectaSchott 系天南星科半夏屬植物掌葉半夏的干燥塊莖［1］，具有燥濕化痰、祛風解痙的作用［2］。據(jù)本草文獻記載，虎掌南星的炮制方法主要有浸制、煮制、煨制、蒸制等，所用輔料主要有生姜、白礬、皂角和膽汁，現(xiàn)代多采用姜礬共煮制［3-5］。其植物來源也較復雜，自明、清以來常與天南星混用，虎掌南星目前是國內(nèi)天南星品種的主流，主產(chǎn)于河南禹州、河北安國等地［6］，其產(chǎn)量大和藥理作用顯著的特點，臨床上常用于治療冠心病、免疫疾病和多種癌癥。生品有毒，其毒性成分為草酸鈣和毒蛋白結合生成的草酸鈣針晶，對黏膜具有刺激性［7］。目前關于虎掌南星有效成分的研究較少，且多側(cè)重于水溶性成分的研究，因此未作為《中國藥典》 規(guī)定的天南星品種來源?；⒄颇闲峭庥^性狀和化學成分與半夏、天南星又很相似，在三者中毒性最強，且常出現(xiàn)混淆的現(xiàn)象，為確保臨床用藥安全，需嚴格區(qū)分。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)了虎掌南星的特征性成分，經(jīng)鑒定為水麥冬酸，可采用液相色譜法與近緣品種鑒別開［8］。

目前2005 年版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》收載有虎掌南星［9］，其炮制方法是先將鮮南星去皮洗凈后自然曬干再浸泡，直至切開口嘗微有麻辣感時取出，再與輔料共同煮至內(nèi)無白心，切片，干燥。由于工藝繁瑣，重復的換水浸泡和干燥的過程勢必影響其中的有效成分，而且對其炮制品合格評判大多以口嘗無麻或微麻舌為指標，缺乏技術參數(shù)指導，而產(chǎn)地加工一體化可有效解決目前炮制工藝不統(tǒng)一的現(xiàn)狀，從根本上確保飲片質(zhì)量。因此，本研究直接對鮮虎掌南星進行產(chǎn)地加工炮制，以口嘗麻辣感和草酸鈣針晶的含有量為指標，通過單因素試驗，確定了生姜用量、煎煮料液、煮沸方式、浸泡前與料液共沸時間，確定了一體化方法；在一體化方法的基礎上，以草酸鈣針晶、水溶性浸出物及水麥冬酸含有量為響應值，加壓溫度、加壓時間、白礬用量為考察因素，采用BOX-Behnken 響應面法優(yōu)選制虎掌南星一體化工藝，流程見圖1。不僅避免了傳統(tǒng)工藝因長時間的浸泡和熱處理造成中藥材品質(zhì)的下降，同時降低了資源消耗成本，量化了炮制工藝參數(shù)，以期為河南省中藥炮制規(guī)范的修訂提供實驗數(shù)據(jù)支撐。

圖1 虎掌南星產(chǎn)地加工炮制一體化工藝流程圖Fig.1 Chart of processing of origin integration technology for P.pedatisecta

1 材料

高效液相色譜儀（島津LC-20AD，SPD-M20 A檢測器，日本島津公司）；PS224S 型天平（萬分之一，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；GTR16-2 高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；LZDX-75KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；KQ-500DV 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；DTC-22 隔膜真空泵（鞏義市英峽予華儀器廠）；DHG-9 077 A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；UPT-Ⅱ-10T 優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；YP10002 電子天平（上海衡際科學儀器有限公司，0.01 g）；BJ-150 型高速多功能粉碎機、精密PH計、ZHPL-200 立式震蕩培養(yǎng)箱、HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海比朗儀器有限公司）。

水麥冬酸對照品（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，純度≥98%）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號4169-2009）；乙酸乙酯（天津市富宇精細化工有限公司，批號13-011-00034）；草酸對照品（英國政府化學家實驗室，批號G451635，純度≥98%）；鹽酸分析純（煙臺市雙雙化工有限公司，批號20121003）；磷酸二氫鉀色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號Q／12HB 4328-2009）；磷酸色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號4169-2009）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；水為超純水。

虎掌南星鮮品購自河南華夏藥材有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院藥學院生藥教研室陳隨清教授鑒定為天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott 的新鮮塊莖。

2 方法與結果

2.1 方法設計 鮮虎掌南星草酸鈣針晶含有量在7.4%左右，為盡可能降低制虎掌南星刺激性成分，以口嘗麻辣感及草酸鈣針晶的含有量為指標，在相同煮制時間下，設計鮮虎掌南星產(chǎn)地加工炮制一體化方法。

2.1.1 生姜用量 取不同量的生姜，切片煎煮2次，去渣，合并煎煮液，加入白礬，對鮮南星進行常壓煎煮，測定各炮制品中草酸鈣針晶的含有量，結果見表1。不同的生姜用量對草酸鈣針晶的含有量影響較小，且8、10 g 的生姜對針晶的含有量幾乎無差別，故選用10 g 生姜。

表1 生姜用量考察Tab.1 Investigation on amount of Z.officinale

2.1.2 煎煮料液與煮沸方式選擇 鮮南星經(jīng)不同的料液處理后再煎煮，可不同程度的降低針晶的含有量。處理方法為，將料液煮沸后趁熱投入鮮南星直接浸泡或南星與料液共同煮沸后再浸泡。有文獻報道，虎掌南星浸泡3 d 后，對Al2O3的吸收已達到飽和，5 d 后物質(zhì)的溶出率已趨于平衡［10］?？紤]長時間浸泡可加速有效成分流失以及引發(fā)霉變，因此將浸泡時間定為2 d。測定各炮制品中草酸鈣針晶的含有量，結果見表2。清水、姜水煮沸后投入鮮南星浸泡，針晶的含有量無顯著差別，礬水對針晶含有量有一定影響，但姜礬水與鮮南星共煮沸浸泡效果較姜礬水煮沸后直接浸泡鮮南星，針晶含有量降低較多，故采用姜礬水與南星共沸的方式浸泡后再煎煮。

表2 料液處理選擇Tab.2 Selection of material-liquid treatment

2.1.3 浸泡前共沸時間考察 由于鮮南星厚度及直徑較大，且質(zhì)地堅硬，與姜礬水共同煮沸后浸泡2 d，再以原汁煎煮6 h，口嘗仍有麻辣感。故考慮延長與料液的共沸時間，使鮮南星的質(zhì)地先變軟，料液便可更充分的浸入內(nèi)部，降低刺激性。各炮制品中草酸鈣針晶的含有量測定結果見表3。結果顯示，與料液共沸80 min 雖比60 min 針晶含有量少，但在煎煮6 h 后藥材容易煮爛，為節(jié)約資源和保證飲片質(zhì)量，故采用姜礬水與鮮南星共煮沸60 min再浸泡。

表3 浸泡前共沸時間考察Tab.3 Investigation of azeotropic time before immersion

2.2 一體化工藝設計

2.2.1 草酸鈣針晶定量測定

2.2.1.1 色譜條件 SymmetryShield RP18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相KH2PO4-H3PO4水溶液（pH 3.0） -甲醇（95 ∶5）；體積流量0.6 mL／min；檢測波長220 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。在上述色譜條件下，草酸對照品及虎掌南星樣品色譜圖見圖2。

圖2 草酸HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms ofoxalic acid

2.2.1.2 對照品溶液制備 稱取草酸對照品5 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻。精密吸取該溶液0.9 mL 至5 mL 量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，使制成1 mL 含0.09 mg 的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液制備 取供試品粉末約0.2 g（過4 號篩），精密稱定，置10 mL 離心管中，加蒸餾水3 mL，搖勻，超聲處理（500 W，40 kHz）5 min，60 ℃水 浴20 min，取 出，放 冷，離 心（10 000 r／min，10 min），棄去上清液。殘渣加20%鹽酸溶液0.5 mL，搖勻，超聲處理5 min，70 ℃水浴30 min，取出，放冷，離心，取上清液置10 mL 量瓶中。沉淀加0.2 mol／L 鹽酸溶液2 mL，同上述方法處理2 次，合并上清液，加水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得［11］。

2.2.1.4 線性關系考察 精密吸取草酸對照品溶液 2、4、6、8、10、12、16、20 μL，在“2.2.1.1” 項條件下進樣，測定峰面積，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y），草酸對照品進樣量為橫坐標 （X） 進行回 歸，得回歸 方程為Y＝592 042.688 6X-2 639.290 713，R2＝0.999 9，表明草酸在0.091～1.820 μg 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.2 水麥冬酸定量測定

2.2.2.1 色譜條件 Symmetry Shield RP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.03%磷酸（2 ∶98）；體積流量0.8 mL／min；檢測波長210 nm；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。在上述色譜條件下，水麥冬酸對照品及虎掌南星樣品色譜圖見圖3。

2.2.2.2 對照品溶液制備 稱取水麥冬酸對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加入流動相定容至刻度，搖勻。精密吸取該溶液0.17 mL 置5 mL量瓶中，加流動相混勻，制成0.034 mg／mL的水麥冬酸溶液。

圖3 水麥冬酸HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms water dwarf lilyturf acid

2.2.2.3 供試品溶液制備 取虎掌南星炮制品粉末約1 g （過4 號篩），精密稱定，加水20.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（500 W，40 kHz） 45 min，放冷，用水補足減失質(zhì)量，離心（10 000 r／min，10 min），精密吸取上清液10 mL 至分液漏斗，加磷酸0.1 mL，搖勻，用乙酸乙酯萃取4 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加適量流動相溶解，定容至2 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得［12］。

2.2.2.4 線性關系考察 精密吸取2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL 水麥冬酸對照品溶液，在“2.2” 項條件下測定。以色譜峰峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X） 進行回歸，得回歸方程為Y＝3 002 830.07X+4 967.11，R2＝0.999 9，表明水麥冬酸在0.068～0.680 μg 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.3 水溶性浸出物測定 按2015 年版《中國藥典》 水溶性浸出物測定法（通則2201） 項下的冷浸法測定，以干燥品來計算供試品中水溶性浸出物的含有量。

2.3 單因素試驗 通過查閱文獻資料，影響虎掌南星飲片質(zhì)量的主要因素有溫度、時間及輔料用量［13］。相比常壓煮制，熱壓法不僅可以縮短時間，降低毒性保留有效成分的含有量，同時可以提高飲片的水溶性浸出物含有量。因此，本研究以草酸鈣針晶的含有量（Y1）、水溶性浸出物（Y2）、水麥冬酸的含有量（Y3） 為響應值，溫度（A，℃）、時間（B，min）、白礬用量 （C，g） 為考察因素，對實驗結果進行綜合評分，探索加壓條件下指標成分含有量變化的規(guī)律。

2.3.1 時間確定 取鮮虎掌南星100 g，大小分檔，洗凈，去皮；生姜10 g，白礬10 g，加水400 mL，按篩選的一體化方法處理后，對鮮虎掌南星進行水蒸汽加熱處理，溫度為120 ℃，時間分別為20、30、40、50、60 min，按上述已建立的指標成分的含有量測定方法進行測定，以綜合評分進行評價。結果表明，加壓時間為40 min 時綜合評分最高，低于40 min 時，水溶性浸出物含有量較低，大于40 min 時，針晶含有量反而升高，故選取加壓時間40 min 作為星點設計的中心點。

2.3.2 白礬用量 取鮮虎掌南星100 g，按篩選的一體化方法處理后進行加壓，溫度為120 ℃，加壓時間為40 min，白礬用量分別為6、8、10、12、14 g，綜合評分結果表明，當白礬加入量為12 g 時綜合評分最高，理論上應選擇12 g為中心點。由于從10 g 的用量增加到12 g 時，綜合評分急劇增加，為了避免白礬殘留Al3+對人體神經(jīng)的毒害，故選取每100 g 虎掌南星加白礬11 g 作為星點設計的中心點。

2.3.3 溫度確定 取鮮虎掌南星100 g，按篩選的一體化方法處理后進行水蒸汽加熱，時間40 min，白礬用量為11 g，加壓溫度分別為105、110、115、120、125 ℃。綜合評分結果表明，溫度越高，綜合評分越高，且125 ℃炮制的飲片表面淡黃褐色，半透明，符合《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》 的要求。考慮到操作過程的安全性和飲片外觀性狀，故以120 ℃加壓作為星點設計的中心點。

2.4 星點設計優(yōu)化制虎掌南星炮制工藝

2.4.1 試驗設計與結果 通過單因素試驗，確定了溫度、時間、白礬用量的中心點及相對范圍，用綜合指標評分法對試驗結果進行分析。在計算綜合指標之前，需先將各指標進行規(guī)格化。對于欲達到最大值的指標（如水麥冬酸的含有量、水溶性浸出物），其規(guī)格化方程＝ （指標值-指標最小值） ／（指標最大值-指標最小值）；對于要求最小化的指標（如草酸鈣針晶的含有量），其規(guī)格化方程為＝（指標最大值-指標值） ／ （指標最大值-指標最小值）。運 用 Design-Expert 8.0.6 軟件中 的BOX-Behnken響應面法設計3 因素3 水平L9（34）的正交試驗，因素水平表見表4，正交試驗與結果見表5。

表4 因素及水平Tab.4 Factors and levels

表5 試驗設計與結果Tab.5 Design and results of tests

2.4.2 方差分析 通過測定各指標成分的含有量，根據(jù)規(guī)格化方程計算出各指標的規(guī)格化值后，進行加權綜合評分（綜合評分＝草酸鈣針晶含有量規(guī)格化值×0.5+水溶性浸出物含有量規(guī)格化值×0.3+水麥冬酸含有量規(guī)格化值×0.2）。以綜合評分為因變量，采用Design Expert 8.0.6 對各因素分別進行多元線性回歸和二項擬合，得到回歸方程Y＝47.11+19.83A+2.19B+10.44C-5.96AB+0.92AC-2.04BC+6.30A2-10.30B2+1.33C2（r＝0.972 7，P＝0.000 1），r值較大，表示實際值與預測值之間的相關性較好，擬合度佳，P＜0.01 表明差異有統(tǒng)計學意義。方差分析結果見表6，結果顯示，該二項式擬合模型中A（加壓溫度） 和C（白礬用量）為極顯著項，對綜合評分的影響較大；3 個因素對虎掌南星炮制品質(zhì)量的影響大小為B大于A大于C。方程的失擬項P＞0.05，表示失擬度不明顯，實驗誤差相對較小。因此可用該模型對制虎掌南星炮制工藝進行分析和預測。

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

2.4.3 響應面與等高線分析 根據(jù)所擬合的回歸方程，應用Design-Expert 8.0.6 軟件，分別繪制綜合評分與溫度、時間、白礬用量3 因素的三維效應面圖和等高線圖，可直觀的反映出各因素之間的交互作用對綜合評分的影響，見圖4。

2.4.4 最佳工藝預測 采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到制虎掌南星的最佳炮制工藝為加熱溫度125 ℃，時間37.19 min，白礬用量12 g，綜合評分的理論值為89.745 1。最終結合生產(chǎn)實際的需要，將最佳工藝調(diào)整為，取白礬生姜加水煮沸后，趁熱倒入鮮南星煮沸60 min，?；鸾? d，再以原汁水蒸汽加熱，溫度為125 ℃，時間為37 min，取出，清水洗凈晾至七成干，鮮虎掌南星與白礬、生姜用量比為100 ∶12 ∶10。

2.4.5 驗證試驗 取同一批次，大小均勻的鮮虎掌南星3 份，每份300 g，按“2.4.4” 項下工藝進行炮制，按“2.2.1” “2.2.2” “2.2.3” 項下進行指標成分的含有量測定，計算綜合評分，結果見表7。

圖4 各因素響應面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

表7 驗證試驗結果（n＝3）Tab.7 Results of verification tests （n＝3）

表7 顯示3 批最佳工藝虎掌南星炮制品的草酸鈣針晶含有量、水麥冬酸含有量、水溶性浸出物含有量、綜合評分RSD 均小于5.0%。其中，平均實際測定值與理論值的相對誤差為2.35%，說明優(yōu)選的二項式模型擬合較好，工藝預測性良好。

3 討論

虎掌南星是中醫(yī)常用藥，炮制品多采用與輔料共同煎煮的方式制得，所溶出的主要成分為氨基酸、糖 類、蛋白質(zhì)、皂 苷，具有祛 痰［14-15］、鎮(zhèn)靜［16-17］、鎮(zhèn)痛［18］、抗腫瘤［19］的作用，對肺癌［20］、肝癌［21］、宮頸癌［22］等多種癌細胞有抑制作用。草酸鈣針晶是虎掌南星的主要毒性成分，主要表現(xiàn)在對咽喉、胃腸黏膜的刺激性，輕則聲音嘶啞，重則窒息死亡。水麥冬酸為虎掌南星特征性成分，通過測定其含有量可有效將虎掌南星與近緣品種鑒別開。

虎掌南星炮制過程中，隨著時間延長和溫度升高，水溶性浸出物提高；白礬用量增加，水浸出物也有所提高?；⒄颇闲侵械牟菟徕}針晶難溶于水及有機溶劑［23-24］，但可溶于強酸、強堿性溶液，白礬溶液呈酸性，因此可能具有溶解草酸鈣針晶的作用，使針晶的尖端變的鈍圓［25］。針晶升高的可能原因是，隨著白礬量的逐漸加入，達到過飽和狀態(tài)，同時由于加熱時間較長，從而使其中還未溶解的草酸鈣針晶又重新滲入藥材內(nèi)部。因此，在虎掌南星的炮制過程中，需保證適當?shù)臏囟?、時間及白礬加入量三者的相互制約。本實驗結合《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》 “虎掌南星” 項下“制虎掌南星” 炮制方法，以口嘗無麻舌或微麻舌控制炮制程度，并定量測定草酸鈣針晶的含有量，將兩者共同作為篩選一體化方法的指標更加客觀準確。

虎掌南星生品有毒，為天南星的3～4 倍［26］，通常與輔料共制后使用?，F(xiàn)代常用輔料為白礬和生姜，其中白礬是制毒的關鍵，生姜不僅可與白礬協(xié)同增強去麻效果，還可去除南星的苦澀味?；⒄颇闲酋r品含水量高不易干燥成原藥材，干燥之后再反復浸泡軟潤易腐爛變質(zhì)和有效成分的流失，且傳統(tǒng)炮制工藝生產(chǎn)周期過長，輔料用量不一致。本實驗通過對鮮虎掌南星一體化工藝的初步研究，量化了炮制過程的工藝參數(shù)，為虎掌南星質(zhì)量標準的制定奠定基礎?；⒄颇闲嵌拘噪m大，但其活性和療效顯著，資源豐富，也是當今出口藥材主要品種之一，建議將虎掌南星收入2015 年版《中國藥典》，作為第一來源或單列為一條“虎掌南星”。為虎掌南星產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。由于不同的炮制工藝對飲片質(zhì)量及有效成分含有量影響較大，有關其炮制之后是否存在新的藥理作用有待進一步研究。