不同規(guī)格延胡索中8 種生物堿比較

李 凱，原軍寧，彭晶晶，蘆夏陽，楊 靖，曹曉燕

（1.陜西師范大學，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室／藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西 西安710062； 2.陜西白云制藥有限公司，陜西 漢中723200）

大部分中藥材都有傳統(tǒng)的等級劃分標準［1］。中藥材商品等級是影響中藥材市場價格的重要因素。目前市場上中藥材商品規(guī)格等級劃分主要有6類，一是依據(jù)野生和栽培區(qū)分規(guī)格等級；二是依據(jù)個頭大?。ù旨殻?區(qū)分規(guī)格等級；三是依據(jù)性狀（質(zhì)地、顏色、形態(tài)） 區(qū)分規(guī)格等級；四是依據(jù)產(chǎn)地區(qū)分規(guī)格等級；五是依據(jù)產(chǎn)地加工方法區(qū)分規(guī)格等級；六是依據(jù)純度區(qū)分規(guī)格等級［2］。在當前的市場中，藥材的大小和粗細在商品等級標準上占有重要地位。

延胡索（Corydalis Rhizoma） 又名元胡、玄胡等，是我國傳統(tǒng)中藥材，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖［3］。與白術、白芍、浙貝母、杭白菊、玄參、筧麥冬、溫郁金并稱“浙八味”?！侗静菥V目》中記載其“能行血中氣滯，氣中血滯，專治一身上下諸痛”［4］。東亞地區(qū)延胡索被廣泛用于治療胸脅、脘腹疼痛、經(jīng)閉通經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、跌撲腫痛等［5-8］?，F(xiàn)代藥理及化學成分研究表明，延胡索中主要有效成分是生物堿類［9］，原阿片堿具有鎮(zhèn)痛、解痙、改善微血管、擴血管等作用［10］；鹽酸巴馬汀具有抑制癌細胞增長的作用［11］；鹽酸小檗堿具有抗炎抗菌［12］、抗腫瘤作用［13］；去氫延胡索甲素（又稱脫氫紫堇堿） 有明顯的抗心肌缺氧缺血、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集等作用［14-18］；海罌粟堿對慢性疼痛有很好的療效，并且沒有耐藥性［19］；四氫小檗堿具有抗高血壓、抗心律失常、抗纖維性顫動、抗急性心肌梗死及對缺血再灌注損傷的治療及保護作用［20］；延胡索乙素和延胡索甲素有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜催眠、抗心律失常、降血壓以及鈣拮抗等作用［21-22］，對慢性鈍痛有極佳鎮(zhèn)痛效果。

延胡索主要分布于浙江、安徽、湖北、河南等地［23］，自2000 年以后，隨著沿海地區(qū)的高速發(fā)展，浙江種植延胡索的面積大幅度減少，主要種植地區(qū)逐漸轉移到陜西漢中地區(qū)［24］。《76 種藥材商品規(guī)格標準》 中延胡索分為一級（每50 g 45 粒內(nèi)） 和二級（每50 g 45 粒以上）。目前在市場上流通的延胡索商品等級劃分已由原來的粒度大小演變成直徑大小，可劃分為特等（直徑＞1.2 cm）、一等（直徑1.0～1.2 cm）、二等 （直徑0.8～1 cm）、三等（直徑＜0.8 cm）、統(tǒng)貨［25］。市場上關于延胡索的規(guī)格劃分主要依靠外觀尺寸，雖然易于量化，便于商品的流通，但是缺乏活性成分含有量等內(nèi)在品質(zhì)的信息。本研究所建立的快速、準確的同時檢測延胡索藥材中8 種生物堿成分含有量的方法，以期為后續(xù)延胡索藥材及飲片的質(zhì)量控制和分析評價奠定基礎。

1 材料

LC-20 A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli 2Q 超純水儀 （德國Millipore 公司）。Agilent 5 TC-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 色譜柱（美國Agilent 公司）。對照品原阿片堿（批號06M18）、鹽酸巴馬?。ㄅ?6Z18）、鹽酸小檗堿（批號05Z18）、去氫延胡索甲素（批號06Z18）、海罌粟堿 （批號06Y18）、延胡索乙素 （批號12M17）、四氫小檗堿（批號06M18）、延胡索甲素（批號06Z18），純度≥98%，均購自天津西瑪科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

延胡索新鮮塊莖于2018 年5 月采集于陜西省漢中市城固縣董家營村，洗凈泥土后，置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎過80 目篩。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%磷酸溶液（三乙胺 調(diào)pH 6.0，B），梯度洗 脫 （0～15 min，20%A；15～35 min，20%A～80%A）；體積流量1.0 mL／min；柱 溫30 ℃；檢測波 長280 nm；進樣量10 μL。按以上色譜條件進行分析，各成分的分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取原阿片堿5.24 mg、鹽酸巴馬汀5.18 mg、鹽酸小檗堿5.16 mg、去氫延胡索甲素5.06 mg、海罌粟堿1.13 mg、延胡索乙素4.60 mg、四氫小檗堿5.11 mg、延胡索甲素5.14 mg，一起混合 加入10 mL 量瓶定容，搖勻，得混合對照品溶液，再依次逐級稀釋。

2.2.2 供試品溶液 取延胡索藥材，按直徑（d）劃分了5 個等級，分別為一級d＞1.5 cm；二級1.2＜d＜1.5 cm；三級1.0＜d＜1.2 cm；四級0.8＜d＜1.0 cm；五級d＜0.8 cm，見圖2，粉碎機粉碎，過80 目篩，精密稱取0.5 g，加入圓底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，冷浸1 h 后加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用濃氨試液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖2 不同規(guī)格延胡索Fig.2 Different grades of Corydalis Rhizoma

2.3 精密度試驗 取同一份對照品，在“2.1” 項條件下，連續(xù)重復進樣6 次，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面積RSD分別 為2.17%、0.86%、1.34%、1.72%、2.4%、1.94%、1.52%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液于室溫下放置，在“2.1” 項條件下，分別于0、2、4、8、16、24 h 進樣6 次，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面積RSD 分別為1.26%、1.84%、2.35%、1.78%、2.17%、1.55%、1.16%、1.96%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性試驗 取同一延胡索樣品6 份，約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面 積 RSD 分別為 1.14%、2.54%、2.18%、1.76%、2.42%、1.24%、2.69%、1.16%，表 明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗 取已知含有量的延胡索樣品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，分別滴加對照品母液1 mL，在“2.1” 項條件下進樣，計算回收率。得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素的回收率（n＝6） 分別為99.7%、99.2%、98.3%、100.6%、102.5%、101.3%、98.4%、99.5%，RSD 分別為 2.21%、1.78%、1.56%、1.23%、0.94%、1.62%、1.02%、0.81%。

2.7 線性關系考察 精密稱定原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素各5.24、5.18、5.16、5.06、1.13、4.60、5.11、5.14 mg，溶解在10 mL 量瓶中，定容至10 mL，按等級稀釋，得到7 個質(zhì)量濃度梯度的對照品，在“2.1”項條件下進樣，以對照品峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表1。

表1 各生物堿線性關系Tab.1 Linear relationships of various alkaloids

2.8 樣品含有量測定 取適量樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣，記錄峰面積，用外標法計算不同規(guī)格延胡索中8 種生物堿的含有量，結果見表2。

2015 年版《中國藥典》 中規(guī)定，按干燥品計算，延胡索中含延胡索乙素不得少于0.050%。按照此要求，5 個等級延胡索中的延胡索乙素含有量均達到要求，其中五級（d＜0.8 cm） 延胡索中延胡索乙素含有量最高（0.13%）。

表2 各生物堿含有量測定結果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various alkaloids （mg／g）

利用SPSS 25.0 軟件進行不同等級之間生物堿含有量的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果表明，不同等級的延胡索中鹽酸巴馬汀含有量不存在顯著性差異；不同等級的延胡索中鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素含有量存在一定的差異，且這6 種生物堿含有量隨著延胡索直徑的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢。不同等級的延胡索中原阿片堿的含有量存在顯著性差異，隨著延胡索直徑的增大呈現(xiàn)遞增的趨勢。

2.9 相關性分析 以SPSS 25.0 軟件中的雙變量相關性（皮爾遜相關系數(shù)，雙尾檢驗） 分析8 種生物堿含有量之間的相關性，達到極顯著差異時（P＜0.01），認為二者存在極顯著相關；當P＜0.05時，認為二者存在顯著相關；否則，不相關。結果見表3，表明原阿片堿和海罌粟堿、延胡索甲素含有量之間存在顯著的負相關性；延胡索乙素和四氫小檗堿、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素含有量之間存在顯著的正相關性。

表3 不同生物堿之間相關性分析Tab.3 Correlation analysis between different alkaloids

3 討論

目前關于延胡索中多個生物堿成分含有量的同時檢測已有相關報道，王歡等［26］利用高效液相色譜法同時檢測了延胡索中9 種生物堿的含有量；陳東東等［27］比較了延胡索炮制前后7 種生物堿含有量的變化。本實驗建立了同時檢測延胡索中8 種生物堿成分的高效液相色譜法，相較于已有文獻報道［26-27］，該方法耗時短，8 種生物堿成分在35 min之內(nèi)能夠得到有效分離和檢測，節(jié)省了檢測時間和試劑消耗。

對于延胡索中生物堿的含有量與商品等級之間的這種矛盾關系，目前有2 種解釋。第一種解釋是一些藥材的次生代謝產(chǎn)物主要分布在藥材的表皮部位，所以直徑越大的藥材表皮所占的比例越小，如黃芩［28］、丹參［29］等，隨著生長年限的增長其根部直徑越粗，表皮所占比例越少，藥材中指標性成分含有量也就越少。第二種解釋是植物在環(huán)境脅迫下會產(chǎn)生一系列變化來適應環(huán)境，惡劣環(huán)境能刺激植物次生代謝的積累和釋放，但造成植物生長緩慢［30］，即植物初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物之間的動態(tài)平衡，也可以解釋延胡索塊莖小而生物堿含有量高這一現(xiàn)象。

呂秋菊等［31］發(fā)現(xiàn)延胡索商品等級越高、塊莖越大，醇溶性浸出物越少，原阿片堿、延胡索乙素和延胡索甲素含有量有隨等級升高而減少的趨勢。本實驗中原阿片堿的含有量隨著延胡索直徑的增大呈現(xiàn)遞增，與之前的研究結果不一致［31］。在所測的8 種生物堿中，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素、海罌粟堿、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素均屬原小檗堿型生物堿，原阿片堿屬于原托品堿型生物堿，海罌粟堿屬于阿樸菲型生物堿，含有量具有正相關的5 種成分均屬于原小檗堿型生物堿；雖然不同類型的生物堿具有共同的生源前體——酪氨酸，但其生源合成途徑又屬于不同的分支，在代謝流不變的情況下，一個分支的代謝流增加了，另一個分支的代謝流則會減少，可以解釋原阿片堿和海罌粟堿、延胡索甲素含有量之間的負相關性。

延胡索乙素是2015 年版《中國藥典》 中規(guī)定的標志性成分，但是臨床上延胡索發(fā)揮藥效是多種成分的協(xié)同作用，單一成分并不能評價延胡索的質(zhì)量?；诂F(xiàn)有評價方法和存在問題，劉昌孝等［32］于2016 年提出了中藥質(zhì)量標志物（Q-marker） 的概念。隨后，張鐵軍等［33］基于化學成分生源途徑及成分特異性、成分的量、藥效、網(wǎng)絡藥理分析、藥性及吸收入血及組織分布、成分的可測性等為標準，提出延胡索定性鑒別必須檢驗其中標志物的3種。本實驗所檢測的8 種生物堿包含了張鐵軍等所建議的7 種生物堿中的5 種，同時增加了阿樸菲型生物堿海罌粟堿，以及鹽酸小檗堿和四氫小檗堿2種原小檗堿型生物堿，其中海罌粟堿被認為是延胡索主要藥效物質(zhì)基礎之一，可作為質(zhì)量標志物［33］。本實驗結果顯示，延胡索乙素和四氫小檗堿、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、去氫延胡索甲素含有量之間存在顯著正相關，可以考慮選取延胡索乙素作為這5 種生物堿的代表，同時增加原阿片堿、鹽酸巴馬汀和海罌粟堿作為延胡索的質(zhì)量標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，原阿片堿的含有量隨著延胡索直徑的增大呈現(xiàn)遞增，因此，如果以單一的原阿片堿含有量作為內(nèi)在品質(zhì)評判的標準，那么延胡索商品等級的劃分是合理的，但其他多種生物堿的含有量卻隨著直徑的增大呈現(xiàn)遞減，因此目前延胡索的等級劃分仍有待商榷。